獲得包含癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞群的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種獲得包含癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞群的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥被認(rèn)為是遺傳疾病且因隨時(shí)間推移基本發(fā)生在四個(gè)或更多的基因上的一系 列突變的作用的累積而形成，如"多階段致癌理論"所提出的。根據(jù)受影響的器官或者特異 性表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的不同，已經(jīng)形成了數(shù)種類型的癌癥；然而，每種癌癥被認(rèn)為是由 單一類型的癌細(xì)胞構(gòu)成的同質(zhì)組織。就此而言，每種抗癌劑，特別是被稱為分子靶向抗癌劑 的抗癌劑，被設(shè)計(jì)為通過(guò)靶向"分子靶標(biāo)"如特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)而攻擊單一或有限類型的 癌細(xì)胞。通常，治療藥物和方法通過(guò)基于例如在癌細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)或從癌細(xì)胞中釋 放并存在于體液中的生物標(biāo)記物如"腫瘤標(biāo)記物"而確定和診斷癌癥的特異性來(lái)決定。
[0003] 作為癌癥難治性的原因，提出了癌癥干細(xì)胞的參與（癌癥干細(xì)胞理論）。雖然已報(bào) 道從多種類型的癌癥（患者組織）中分離癌癥干細(xì)胞，但由于其豐度低且在培養(yǎng)中難以穩(wěn) 定保持，癌癥干細(xì)胞的分離和純化較為困難，且這已經(jīng)阻礙了大規(guī)模的研究和分析。而且， 并非所有的癌癥干細(xì)胞已被分離。假定腫瘤組織中的癌細(xì)胞的類型在患者之間各不相同且 其是異質(zhì)的和有限的。鑒于此并結(jié)合在把握所有種類的癌細(xì)胞中的困難，許多研究者對(duì)癌 癥干細(xì)胞本身的存在以及癌癥干細(xì)胞在癌癥進(jìn)展和惡化中所起的作用表達(dá)了否定的觀點(diǎn)。 日本專利公開(kāi)第2010-13380號(hào)（引入本文以供參考）公開(kāi)了一種通過(guò)使用癌癥干細(xì)胞篩 選殺死癌癥干細(xì)胞的物質(zhì)的方法。
[0004] 常規(guī)的使用抗癌劑的癌癥療法總是被例如癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問(wèn)題所困擾。治療 效果按照例如"五年存活率"表示，且總存活數(shù)（OS)或存活益處（survivalbenefit)被用 作終點(diǎn)（指標(biāo)）。即，實(shí)際上，癌癥難以"根治"是共識(shí)。推測(cè)很少達(dá)到癌癥的"根治"是由 于以下原因。即，最終，抗癌劑，包括分子靶向藥物，僅對(duì)群體中的特異性癌細(xì)胞有效，而對(duì) 剩余的呈現(xiàn)異質(zhì)性的癌細(xì)胞或癌癥干細(xì)胞無(wú)效。結(jié)果，治療操作偶然地最終變成幫助那些 剩余的癌細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞增殖，從而引起復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此推測(cè)幾乎沒(méi)有癌癥被"根治" 的案例。需要的不僅是對(duì)新的治療方法和治療靶標(biāo)的探索，還需要針對(duì)癌細(xì)胞"異質(zhì)性"的 了解和措施。
[0005] 癌癥干細(xì)胞可以使用標(biāo)記物蛋白質(zhì)例如⑶133和⑶44作為指標(biāo)，通過(guò)例如使 用磁珠的分離方法（Jin等人，2008.Neuroscience;154, 541-550 (引入本文以供參考）、 MiltenyiBiotecGmbH制造的DiamondCD133IsolationKit)、涉及用流式細(xì)胞術(shù)分離 和收集的方法（Griguer等人，2008.PlosOne;3 (11)e3655(引入本文以供參考））、以及 激光顯微解剖（LeicaCameraAG制造的LMD6500&LMD7000)而被濃縮。為培養(yǎng)和保持隔 離或分離的癌癥干細(xì)胞，可以使用與透明質(zhì)酸聚合的凝膠或者在透明質(zhì)酸與明膠之間通 過(guò)聚合所獲得的凝膠（Rehfeldt等人，2012Integr.Biol. ;4, 422-430(引入本文以供參 考），Sigma-AldrichCorporation制造的Hystem)、膠原凝膠（NipponBectonDickinson Company,Ltd.制造的Matrigel)等等。常規(guī)的用于分離表達(dá)⑶-44的細(xì)胞的技術(shù)需要昂貴 的儀器和試劑、用于安裝待使用的儀器的空間以及相關(guān)的使用儀器的專業(yè)技能。此外，由于 分離的細(xì)胞須保持在聚合凝膠中或凝膠表面上，因此當(dāng)細(xì)胞不表達(dá)熒光蛋白，或者無(wú)法進(jìn) 行細(xì)胞染色等時(shí)，在明視場(chǎng)中觀察細(xì)胞是極其困難的。而且，制備均一凝膠和將細(xì)胞條件保 持在恒定的水平較為困難。同時(shí)，所培養(yǎng)的細(xì)胞的收集和傳代以及細(xì)胞分泌的因子等的收 集極其困難。此外，另一個(gè)問(wèn)題是將細(xì)胞暴露于藥物、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等較為困難。
[0006] 引用列表
[0007] 專利文件
[0008] 專利文件I:JP2〇l〇-l338〇A
[0009] 非專利文件
[0010] 非專利文件IJin等人，2008.Neuroscience; 154, 541-550。
[0011] 非專利文件 2:Griguer等人，2008.PlosOne;3 (11)e3655。
[0012] 非專利文件 3:Rehfeldt等人，2012Integr.Biol. ;4, 422-430。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的是提供一種獲得包含癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞群（特別是，包含癌細(xì)胞的 細(xì)胞群）的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種濃縮表達(dá)CD44的細(xì)胞的方法。
[0014] 本發(fā)明首次涉及通過(guò)培養(yǎng)iPS細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞。雖然所誘導(dǎo)的癌癥干細(xì) 胞可能被區(qū)別于癌癥干細(xì)胞的癌細(xì)胞所污染，但是可以在除去污染的癌細(xì)胞之后使用該癌 癥干細(xì)胞。同時(shí)，已知多種癌癥干細(xì)胞表達(dá)高水平的⑶44。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)向培養(yǎng)基中加入透 明質(zhì)酸以濃縮癌癥干細(xì)胞時(shí)，表達(dá)高水平CD44的細(xì)胞被意外地高效濃縮，借此完成了本發(fā) 明。雖然具體實(shí)例將在以下顯示，但是本發(fā)明不限于此。
[0015] 1. -種獲得包含癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，其包括在癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液的存 在下培養(yǎng)iPS細(xì)胞。
[0016] 2.前述1所述的方法，其中iPS細(xì)胞是人細(xì)胞。
[0017] 3.前述1或2所述的方法，其中培養(yǎng)時(shí)間為2周至2個(gè)月。
[0018] 4.前述1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)該方法獲得的細(xì)胞群包含癌細(xì)胞。
[0019] 5.通過(guò)前述1-4中任一項(xiàng)所述的方法獲得的細(xì)胞群。
[0020] 6. -種獲得癌癥干細(xì)胞的方法，其包括分離前述5所述的細(xì)胞群中包含的癌癥干 細(xì)胞。
[0021] 7.通過(guò)前述6所述的方法獲得的癌癥干細(xì)胞。
[0022] 8. -種篩選抗癌劑的方法，其包括以下步驟：
[0023] (1)使前述5所述的包含癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞群或者前述7所述的癌癥干細(xì)胞與抗 癌劑候選物相接觸，以及
[0024] (2)確定候選物在細(xì)胞群或細(xì)胞上的效果。
[0025] 9.前述8所述的方法，還包括選擇抑制細(xì)胞群或細(xì)胞的增殖的候選物的步驟。
[0026] 10.前述8或9所述的方法，其包括使前述5所述的包含癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞群與抗 癌劑候選物接觸的步驟。
[0027] 11. -種濃縮表達(dá)⑶-44的細(xì)胞的方法，其包括在非粘附性條件下在透明質(zhì)酸的 存在下培養(yǎng)包含表達(dá)CD-44的細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0028] 12.前述11所述的方法，其中細(xì)胞群是人細(xì)胞群。
[0029] 13.前述11或12所述的方法，其中培養(yǎng)時(shí)間是2周至2個(gè)月。
[0030] 14. -種細(xì)胞群，包含通過(guò)前述11-13中任一項(xiàng)所述的方法濃縮的表達(dá)⑶44的細(xì) 胞。
[0031] 通過(guò)本發(fā)明能夠獲得包含在活體中構(gòu)成腫瘤的多種癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞群以及多 種癌癥干細(xì)胞。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1示出通過(guò)miPS-LLCcm細(xì)胞的腫瘤形成；
[0033] 圖2示出通過(guò)miPS-LLCcm細(xì)胞形成的腫瘤的組織學(xué)評(píng)價(jià)；
[0034] 圖3示出通過(guò)miPS-LLCcm細(xì)胞形成的腫瘤的免疫染色結(jié)果；
[0035] 圖4示出在Matrigel(R)中形成血管樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞；
[0036] 圖5示出從源自miPS-LLCcm細(xì)胞的惡性腫瘤中分離的原代細(xì)胞培養(yǎng)及其懸浮培 養(yǎng)。原代培養(yǎng)顯示出從在移植有miPS-LLCcm細(xì)胞的裸鼠中形成的瘤塊中獲得的細(xì)胞。懸 浮培養(yǎng)顯示出通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)miPS-LLCcm細(xì)胞而獲得的球狀體。左邊的圖片 顯示出GFP表達(dá)；
[0037] 圖6示出由miPS-LLCcm細(xì)胞的球狀體形成的腫瘤的免疫染色結(jié)果；
[0038] 圖7左）示出p53的表達(dá)，其是代表性的腫瘤抑制基因，且右）示出基質(zhì)金屬蛋白 酶2 (MMP2)的表達(dá)，其參與到癌癥的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移；
[0039] 圖8示出干細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)；
[0040] 圖9示出通過(guò)球形自組織映射的小鼠iPS-CSC的基因表達(dá)情況的可視化。在圖中， 在頂行左起第二和第三個(gè)細(xì)胞以及底行最左邊和左起第二個(gè)細(xì)胞中，主要在中央顯示紅色 (基因表達(dá)比在iPS細(xì)胞中水平更高），其被藍(lán)色（基因表達(dá)比在iPS細(xì)胞中水平更低）環(huán) 繞。在頂行最右邊的細(xì)胞和底行左起第二個(gè)細(xì)胞和最右邊的細(xì)胞中，主要是在右邊區(qū)域中 顯示紅色且在左邊區(qū)域中顯示藍(lán)色；
[0041] 圖10示出在各自獨(dú)立的細(xì)胞之間基因表達(dá)的比較；
[0042] 圖11-1示出在癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的存在下培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞⑴；
[0043] 圖11-2示出在癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的存在下培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞⑵；
[0044] 圖11-3示出在癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的存在下培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞（3);
[0045] 圖11-4示出在癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的存在下培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞⑷；
[0046] 圖11-5示出在癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的存在下培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞（5);
[0047] 圖12示出從人iPS細(xì)胞中誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞；
[0048] 圖13示出以rBC2LCN-FITC檢測(cè)足細(xì)胞標(biāo)記蛋白（podocalyxin);
[0049] 圖14是顯示在不添加rBC2LCN-FITC的情況下的一組圖；
[0050] 圖15示出在裸鼠中的腫瘤形成；
[0051] 圖16示出從0CC-hiPS-29細(xì)胞中誘導(dǎo)干細(xì)胞；
[0052] 圖17示出0CC-hiPS-29細(xì)胞的自更新能力；
[0053] 圖18示出通過(guò)球形自組織映射的人iPS-CSC的基因表達(dá)情況的可視化。在圖中， 在左側(cè)黑色區(qū)域中顯示藍(lán)色（基因表達(dá)比在iPS細(xì)胞中水平更低），而在右下和左下角區(qū)域 中（在底行左起第四個(gè)細(xì)胞以及最右邊的細(xì)胞中）或者在右下角區(qū)域中（在所有其他細(xì)胞 中）顯示紅色（基因表達(dá)比在iPS細(xì)胞中水平更高）。
[0054] 圖19示意性地示出使用源自人膠質(zhì)瘤的U251MG細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。
[0055] 圖20示出在具有透明質(zhì)酸（HA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
[0056] 圖21示出對(duì)HA濃度的研究；
[0057] 圖22示出非粘附性皿中的培養(yǎng)。具有：具有HA的培養(yǎng)基，不具有：不具有HA的培 養(yǎng)基（普通培養(yǎng)基）；
[0058] 圖23示出細(xì)胞從球體的解離和自更新；
[0059] 圖24-1示出⑶44基因表達(dá)水平的比較。A:A172細(xì)胞；
[0060] 圖24-2示出CD44基因表達(dá)水平的比較。B:U251MG細(xì)胞；
[0061] 圖24-3示出CD44基因表達(dá)水平的比較。C:U251MG-P1細(xì)胞；
[0062] 圖25示出相對(duì)于U251MG細(xì)胞在U251MG-P1細(xì)胞中CD44基因的表達(dá)水平；
[0063] 圖26示出通過(guò)在具有HA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的U251MG細(xì)胞的腫瘤形成；
[0064] 圖27示出⑶44蛋白質(zhì)表