葡萄糖異構(gòu)化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及葡萄糖異構(gòu)化的方法及在果糖和葡萄糖的混合物中富集果糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] D-葡萄糖在多種生物聚合物在中大量存在，該生物聚合物是再生原材料的一部 分。其示例為淀粉（如玉米淀粉）或纖維素（木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的纖維素）。
[0003] 將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖的常見(jiàn)可能性是通過(guò)采用適當(dāng)?shù)腄-葡萄糖異構(gòu)酶（如 D-木糖異構(gòu)酶）進(jìn)行的，該D-葡萄糖異構(gòu)酶接受D-葡萄糖作為底物。這樣的方法已經(jīng)知 曉很長(zhǎng)一段時(shí)間（如從US2950228)且仍然適合工業(yè)使用，例如在US3616221或US386830 中所描述的。
[0004] 該方法所伴隨的一個(gè)問(wèn)題是通常最多大約42%的D-葡萄糖能夠被轉(zhuǎn)化為D-果 糖。D-果糖對(duì)D-葡萄糖的進(jìn)一步富集只有通過(guò)分離方法才可實(shí)現(xiàn)。因此一種可能性是采 用色譜法，如描述在US5221478中的示例。食品行業(yè)通常只追求部分富集D-果糖。特別地， 用于生產(chǎn)相對(duì)較純到高純度D-果糖的色譜法是相當(dāng)費(fèi)力的。
[0005] 除了使用異構(gòu)酶之外，文獻(xiàn)還描述了對(duì)碳水化合物進(jìn)行酶促氧化還原反應(yīng)。
[0006] 例如，DE69839381描述了用于將D-山梨醇轉(zhuǎn)化成L-山梨醇且可用于產(chǎn)生抗壞血 酸生的山梨醇脫氫酶。
[0007] DE10247147描述了一種通過(guò)采用D-甘露糖醇-2-脫氫酶將D-果糖還原成D-甘 露糖醇的方法。
[0008] US4467033描述了將L-山梨醇酶促氧化成L-果糖。
[0009] 將D-木糖還原成木糖醇的示例為，例如US20060035353或Woodyer R.等人.，在 FEBS J.，2005, 272卷，3816-3827頁(yè)中所描述的內(nèi)容。
[0010] 已經(jīng)表明，可以采用適當(dāng)?shù)哪咎沁€原酶將D-葡萄糖還原為D-山梨醇（如Wang X?等人?，Biotechnol. Lett.，2007, 29 卷，1409-1412 頁(yè)）。
[0011] 糖氧化還原酶（如山梨糖醇脫氫酶）還用于診斷目的（如DE60006330)。
[0012] 這些方法是單獨(dú)的氧化還原反應(yīng)，其中發(fā)生還原反應(yīng)或發(fā)生氧化反應(yīng)以形成每個(gè) 產(chǎn)物。在工業(yè)過(guò)程中，酶催化氧化還原反應(yīng)，例如用于產(chǎn)生手性醇、Q-氨基酸和Q-羥基 酸。目前已知的工業(yè)過(guò)程通常采用用于產(chǎn)品合成的氧化還原酶，以及任選地另一種用于再 生輔酶因子的酶。與此形成對(duì)比的方法是在產(chǎn)物形成過(guò)程中涉及的兩個(gè)以上酶促氧化還 原反應(yīng)以及輔酶因子再生所必需的任何酶促反應(yīng)是在一個(gè)反應(yīng)批次中進(jìn)行的（同時(shí)或相 繼），無(wú)需分離任何中間物。近來(lái)，這種酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)-這里被稱為一鍋反應(yīng)-已經(jīng)吸引了 大量關(guān)注，因?yàn)樗鼈兡苡行Ы档筒僮鞒杀尽⒉僮鲿r(shí)間和對(duì)環(huán)境的影響。此外，氧化還原的酶 促級(jí)聯(lián)反應(yīng)允許利用經(jīng)典化學(xué)方法不易實(shí)施轉(zhuǎn)化的發(fā)生。
[0013] 描述了一種嘗試，其中以前手性酮作為中間體并利用一鍋體系實(shí)現(xiàn)了仲醇的外消 旋體的去消旋化（J. Am. Chem. Soc.，2008, 130卷，13969-13972頁(yè)）。通過(guò)兩個(gè)具有不同的 輔酶因子特異性的醇脫氫酶（S-和R-特性）實(shí)現(xiàn)了仲醇的去消旋化。這種方法的缺點(diǎn)是 所使用的底物具有非常低濃度0. 2-0. 5%，不適于工業(yè)用途。
[0014] 在WO 2009/121785描述了另一個(gè)一鍋體系，其中光學(xué)活性仲醇的立體異構(gòu)體被 氧化成酮，然后被還原成相應(yīng)的旋光對(duì)映體，且其中使用了兩種具有相反的立體選擇性和 不同的輔酶因子特異性的醇脫氫酶。輔酶因子利用所謂的"雜交轉(zhuǎn)化體系"只采用一個(gè)額 外的酶進(jìn)行再生。為了再生輔酶因子，使用了不同的酶，如甲酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、乳酸 脫氫酶。這種方法的缺點(diǎn)是所用底物的低濃度。
[0015] 相比之下，知曉許多個(gè)體酶促氧化還原反應(yīng)。生產(chǎn)手性羥基化合物的示例性應(yīng)用 是基于相應(yīng)的前手性酮化合物。在這種方法中，通過(guò)額外的酶對(duì)輔酶因子進(jìn)行再生。所有 這些方法的共同點(diǎn)是它們代表孤立的還原反應(yīng)并再生NAD (P)H(參見(jiàn)如EPl 152054)。
[0016] 酶法生產(chǎn)手性化合物、富集的對(duì)映體化合物、有機(jī)化合物（例如醇類或氨基酸類） 的其他示例已被描述（Organic Letters, 2003, 5 卷，3649-3650 H;US7163815;Biochem. Eng. J. ,2008,39(2)卷，319-327頁(yè)；EP1285962)。在這些體系中，來(lái)自于短乳桿菌或舊金 山乳酸菌的NAD (P) H-依賴性氧化酶被用作輔酶因子再生酶。這些嘗試也代表用于形成產(chǎn) 品的個(gè)體反應(yīng)。
[0017] 如上所述的單獨(dú)進(jìn)行的氧化反應(yīng)或還原反應(yīng)缺乏一鍋反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，如通過(guò)減少時(shí) 間和材料的效率。
[0018] 例如，根據(jù)在US4895601或US504708中所描述的方法從水溶液中分離果糖是有可 能的。
[0019] 至今已知的所有方法具有不同的缺點(diǎn)，例如底物的初始濃度較低，總收益率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 令人驚奇的是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在葡萄糖向果糖的異構(gòu)化過(guò)程中實(shí)現(xiàn)更好富集果 糖的可能性。
[0021] -方面，本發(fā)明提供了一種通過(guò)將葡萄糖還原成山梨糖醇并繼而氧化成果糖而對(duì) 葡萄糖進(jìn)行異構(gòu)化的方法，其特征在于葡萄糖和果糖的混合物被用作起始材料，在所述方 法中氧化還原輔酶因子NAD7NADH和NADP7NADPH在一鍋反應(yīng)中再生，其中所述兩個(gè)氧化 還原輔酶因子中的一個(gè)得到的是其還原形式，另一個(gè)氧化還原輔酶因子得到的是其氧化形 式，因?yàn)樵谙嗤姆磻?yīng)批次中發(fā)生至少兩個(gè)額外的酶催化的氧化還原反應(yīng)（產(chǎn)品形成反 應(yīng)），其中
[0022] a)在將所述還原型輔酶因子轉(zhuǎn)化回其原來(lái)的氧化形式的再生反應(yīng)中，氧氣或通式 I的化合物被還原，
[0024] 其中札是直鏈或支鏈的（CV4)-烷基基團(tuán)或（Cq)-羧烷基基團(tuán)，以及
[0025] b)在將所述氧化型輔酶因子轉(zhuǎn)化回其原來(lái)的還原形式的再生反應(yīng)中，（C4_ s)環(huán)烷 醇或通式II的化合物被氧化，
[0027] 其中私和R3各自獨(dú)立地選自由氫、直鏈或支鏈的（C 〇)烷基、直鏈或支鏈并含有 一個(gè)到三個(gè)雙鍵的（C26)烯基，芳基、特別是（C6- 12)芳基），羧基或（C1-O羧烷基，特別是環(huán) 烷基、如（C3_ s)環(huán)烷基組成的組。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明提供的方法在本文中也被稱作"根據(jù)本發(fā)明的方法"或"本發(fā)明的方 法"。
[0029] 另一方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其中a)中通式I的化合物被還 原，其中R 1是取代或未取代的（Cq)烷基基團(tuán)，以及b)中通式II的化合物被氧化，其中R2 和R3獨(dú)立地選自由氫，直鏈或支鏈的（C^6)烷基，直鏈或支鏈并任選地含有多達(dá)三個(gè)雙鍵 的（C 26)烯基環(huán)烷基、特別是（C3_s)環(huán)烷基，芳基、特別是（C6_ 12)芳基，（Cf4)羧烷基組成 的組，如果化合物I是丙酮酸鹽，任選地私和R 3還為羧基。
[0030] 另一方面，在根據(jù)本發(fā)明的一種方法中，私和1?3獨(dú)立地選自由氫、直鏈或支鏈的 (C^ 6)烷基、直鏈或支鏈并含有一個(gè)到三個(gè)雙鍵的（C2 6)烯基、芳基（特別是（C6_12)芳基）、 羧基或（C1-O羧烷基組成的組。在一個(gè)具體的方面，根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)按照以下反應(yīng)方案 1進(jìn)行：
[0031] 反應(yīng)方案1
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)相比，根據(jù)本發(fā)明的方法表現(xiàn)出將化合物酶促氧化或還原的方法 的顯著改進(jìn)，因?yàn)樵摲椒ㄔ试S在一個(gè)反應(yīng)批次中進(jìn)行所述必要的氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)以及 所述相應(yīng)的輔酶因子再生的反應(yīng)，并同時(shí)允許使用比根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)顯著較高的底物濃度。
[0034] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，使用了所述輔酶因子NADH和NADPH，在此，NAD+代表煙酰 胺腺嘌呤二核苷酸的氧化形式及NADH代表煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原形式，而NADP +代 表煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化形式及NADPH代表煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的還 原形式。
[0035] 在本文中，術(shù)語(yǔ)"氧化反應(yīng)"和"還原反應(yīng)"代表那些不屬于輔因子再生的一部分 且不涉及在根據(jù)本發(fā)明的方法中形成產(chǎn)品的酶催化氧化還原反應(yīng)。"氧化反應(yīng)"和"還原反 應(yīng)"共同地被稱為"產(chǎn)品形成反應(yīng)"。在根據(jù)本發(fā)明的方法中的所述產(chǎn)品形成反應(yīng)的每個(gè)反 應(yīng)包括至少一個(gè)氧化反應(yīng)和至少一個(gè)還原反應(yīng)。
[0036] 如果NAD+用作所述氧化反應(yīng)的輔酶因子，那么NADPH是所述還原反應(yīng)的輔酶因 子。如果NADP +用作所述氧化反應(yīng)的輔酶因子，那么NADH是所述還原反應(yīng)的輔酶因子。
[0037] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)可以在相同反應(yīng)批次中并行進(jìn)行或 不并行發(fā)生，即相繼發(fā)生。
[0038] 在本文中，底物指的是那些用來(lái)以形成產(chǎn)物為目標(biāo)的化合物。在本文中，共底物指 的是那些在輔酶因子再生過(guò)程中被轉(zhuǎn)化的化合物。
[0039] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，使用幾種底物（即葡萄糖和山梨糖醇）。在此，在相同的 底物（分子骨架）上發(fā)生還原反應(yīng)和/或氧化反應(yīng)。另外，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，在分子 骨架的不同位置的兩個(gè)不同官能基團(tuán)上發(fā)生還原反應(yīng)和氧化反應(yīng)。
[0040] 在本文中，"一鍋反應(yīng)"指的是一種方法，在該方法中，在一個(gè)反應(yīng)批次中發(fā)生涉及 產(chǎn)品形成和用于輔酶因子再生的兩個(gè)酶促體系的兩個(gè)以上氧化還原反應(yīng)，而不需要分離中 間體中間體。
[0041] 本文中提及的酸或酸性鹽包括沒(méi)有說(shuō)明的相應(yīng)的其他術(shù)語(yǔ)。同樣，在本文中提及 的酸包括所有由此派生的酯類。另外，（部分地）帶有保護(hù)基團(tuán)的化合物包括在提及的潛 在物質(zhì)中。
[0042] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于氧化反應(yīng)和還原 反應(yīng)并行發(fā)生。
[0043] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于在同一分子骨架 上發(fā)生氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)。
[0044] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)