解淀粉芽胞桿菌ncpsj7抗菌多肽及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7抗菌多肽及其制備方法，屬于抗菌多肽制備技術領域。
【背景技術】
[0002]植物病害主要成因是病原菌侵害植物，由此造成巨大的經(jīng)濟損失?；瘜W農(nóng)藥在消滅病原菌，避免植物病害，減少損失等方面發(fā)揮了主要作用。但長期大量使用化學農(nóng)藥存在著潛在的危害，它引起環(huán)境污染，導致農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留增加，造成食品安全性問題日益嚴重，直接危害人類健康；化學農(nóng)藥在抑制病原菌的同時也殺傷了其他有益微生物、昆蟲和畜禽，破壞了生態(tài)平衡；并且，病原真菌和細菌抗藥性不斷加深和擴大，不得不加大農(nóng)藥的施用量，從而會造成化學農(nóng)藥應用的惡性循環(huán)。
[0003]隨著人們環(huán)保意識的增強，以及對化學農(nóng)藥負面影響的深入了解，如何高效殺死作物病原菌，同時維護生態(tài)平衡，獲得優(yōu)質、安全的農(nóng)產(chǎn)品成為人們日益關注的問題，促使人們去尋求安全有效的植物病害防治途徑。利用生物防治(即微生物代謝產(chǎn)物(農(nóng)用抗生素)或微生物活菌制劑)防治植物病害不僅避免了化學農(nóng)藥帶來的一系列問題，而且安全、有效和持久，己經(jīng)發(fā)展成為防治植物病害的一種有效措施，受到廣泛的關注。但目前限于微生物菌體的生物防治研究，拮抗微生物所分泌的次生代謝產(chǎn)物的防治研究還僅僅停留在實驗室階段。因此，從拮抗微生物中分離更加穩(wěn)定高效的拮抗物質，為推廣抗菌物質進行大規(guī)模防治植物病害創(chuàng)造條件，為防治植物病害的生物技術開發(fā)奠定基礎。
[0004]解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7自山東省萊蕪市生姜大田土壤中分離得到，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2013098 (專利申請?zhí)?CN201310112580.9，發(fā)明名稱:廣譜抗菌解淀粉芽孢桿菌菌株及其應用)，發(fā)明菌株的菌體及發(fā)酵液具有措抗桃根霉腐爛病、黃瓜枯萎病、番前灰霉病、率炭疽病、梨黑斑病、梨青霉病、蘋果褐腐病、蘋果斑點落葉病、西瓜枯萎病等植物病原真菌引起的植物病害及果蔬采后病害以及拮抗金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門氏菌、副溶血性弧菌、酵母等食源性致病菌和腐敗菌的作用。一種解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7抗菌蛋白產(chǎn)品及其制備方法，中國專利201410198531.6，公開了一種具有廣譜抗菌性能的抗菌蛋白，其分子量為20_40kDa，其主要成分為:24kDa和36kDa兩種抗菌蛋白；其外觀形態(tài)表現(xiàn)為棕黃色粉末。實驗證明，其對西瓜枯萎病菌最低抑菌濃度為0.086mg/mL。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種能顯著抑制西瓜枯萎病菌的活性的抑菌多肽及其制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術方案
一種解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7抗菌多肽，其分子量為3.0-5.8KDa，對西瓜枯萎病菌最低抑菌濃度為0.031mg/mL。
[0007]本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7抗菌多肽，其表觀形態(tài)為淺黃色粉末；其適用溫度范圍4-80° C ;其適用pH范圍1-11。
[0008]上述解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7抗菌多肽，優(yōu)選的，其分子量為3.0-4.5KDa ;在此分子量范圍內的多肽的抑菌活性更好。
[0009]—種上述解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7抗菌多肽的制備方法，包括以下步驟:
(1)解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液離心后于上清液中加入硫酸銨至80%的飽和度，于4°C靜置24h后離心，沉淀用B復溶，得復溶液；
(2)將復溶液以B為緩沖液，用透析袋進行脫鹽，得到濃縮液；
(3)濃縮液用DEAE陰離子交換層析柱進行分離:用B平衡層析柱，以NaCl含量為0.4mol/L的B為洗脫液洗脫，收集洗脫峰，得活性組分I ;
(4)活性組分I用Superdex75排阻層析柱分離:洗脫液為B，收集第二個洗脫峰，得活性組分2 ;
(5)活性組分2中的緩沖液用NaCl含量為1.5mol/L的B替換后用辛基瓊脂糖_4疏水層析柱進行純化:先進行0-100%B線形洗脫，然后進行B-C-ddH20的梯度洗脫，梯度洗脫時收集洗脫峰，得產(chǎn)品；
所述B為pH為7.0、濃度為50 mmol/L的PBS ；
所述C為濃度為20mmol/L的PBS ；
所述透析袋的截留分子量MwCO彡3000。
[0010]MwCO不同，濃縮液的多肽的分子量分布不同，本發(fā)明采用MwCO彡3000的透析袋的目的在于獲得本發(fā)明的多肽。
[0011]硫酸銨的飽和度不同，所獲得的沉淀中的多肽不同；采用80%的飽和度的目的在于獲得本發(fā)明的多肽。
[0012]DEAE陰離子交換層析柱，是指柱徑26 mm、填料高100 mm的二乙基氨基乙基陰離子交換層析柱。
[0013]Superdex 75排阻層析柱，柱徑16 _，填料層900 mm。
[0014]辛基瓊脂糖-4疏水層析柱，柱徑16 mm，填料層100 mm。
[0015]本發(fā)明中的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液，是由解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens NCPSJ7 進行培養(yǎng)、發(fā)酵而成。
[0016]有益效果
本發(fā)明采用硫酸銨沉淀、脫鹽、陰離子交換、排阻層析、疏水層析等純化手段，純化得到一種解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7抗菌多肽。所制備的抗菌多肽，能明顯抑制西瓜枯萎病菌的活性(對西瓜枯萎病菌最低抑菌濃度為0.031mg/mL)，且具有較強的熱穩(wěn)定性、耐酸堿，具有潛在的應用價值。
【附圖說明】
[0017]圖1，為排阻層析圖譜；
圖2，為辛基瓊脂糖疏水層析，50 mmol/L PBS-20 mmol/L PBS _ddH20梯度洗脫圖譜； 圖3，為辛基瓊脂糖疏水層析后，洗脫峰抑菌效果圖；
圖4，為辛基瓊脂糖疏水層析后，活性洗脫峰I的電泳圖譜；15.5% Tricine-SDS-PAGE:A，疏水層析后的電泳條帶；B，低分子量蛋白marker，從上到下主條帶分子量分別為22.0,14.4，7.8，5.8，3.3 ；
圖5，本發(fā)明的對比例不同濃度抗菌多肽的抑菌結果圖；
圖6，本發(fā)明的抗菌多肽溫度穩(wěn)定性實驗結果圖；
圖7，本發(fā)明的抗菌多肽酸堿度穩(wěn)定性實驗結果圖；
圖8，對比例不同濃度抗菌蛋白的抑菌結果圖。
【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明所用DEAE陰離子交換層析柱、Superdex 75排阻層析柱、辛基瓊脂糖_4疏水層析柱，均購于GE醫(yī)療中國，產(chǎn)品型號分別為17-0709-01、17-1044-01、17-0946-02。
[0019]實施例1抗菌多肽粗品濃縮液的制備
解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7的培養(yǎng)和發(fā)酵條件見“廣譜抗菌解淀粉芽孢桿菌菌株及其應用”的實施例2，中國專利2013101125809。
[0020]將4L發(fā)酵上清液經(jīng)10000 r/min離心10 min (該離心參數(shù)可用其他參數(shù)替換，對結果無影響)，保留上清液；上清液中加入硫酸銨至80%的飽和度，然后于4°C靜置24小時，經(jīng)11000 r/min離心20 min (該離心參數(shù)可用其他參數(shù)替換，對結果無影響)，沉淀用約50mL濃度為50 mmol/L、pH 7.0的PBS復溶，得復溶液。
[0021]將復溶液放入透析袋(截留分子量MwCO ( 3000)中，將透析袋放入裝有1000 mL的濃度為50 mmol/L, pH 7.0的PBS (作為緩沖溶液)燒杯中，將燒杯放在磁力攪拌器上攪拌，每隔2 h置換緩沖溶液，24 h后，換液間隔時間為6-8 h，48 h后回收透析袋中溶液，SP為粗品濃縮液。
[0022]實施例2 DEAE陰離子交換層析柱層析
濃縮液用柱徑26 _、填料高100 mm的DEAE陰離子交換層析柱進行分離(其中，柱徑、填料高均為常規(guī)選擇，選擇其他柱徑、填料高對結果無影響):常壓上樣，然后使用濃度為50mmol/L,pH 7.0的PBS平衡2個柱體積，再以NaCl含量為0.4mol/L的濃度為50 mmol/L,pH 7.0的PBS為洗脫液進行洗脫，設置流速I mL/min (該流速為常規(guī)設置，其變化不影響結果)，設置紫外檢測儀的吸收波長為280 nm