?；葝u素的色譜純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種?；葝u素的反相色譜純化方法，屬于重組胰島素或胰島素類似 物的制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種常見的代謝內(nèi)分泌疾病，嚴(yán)重危害人類健康。酰化胰島素是一種中 性的、可溶的、長效胰島素類似物，例如地特胰島素，即賴氨酸B29N(e-十四酰）去（B30) 人胰島素，是第一個采用化學(xué)修飾的方法，用能與血液中的白蛋白可逆結(jié)合的脂肪酸?；?肽鏈上的氨基酸而產(chǎn)生。酰化的脂肪酸可穩(wěn)定胰島素分子的自身聚集，且與白蛋白可逆性 結(jié)合，使?；葝u素從皮下注射部位吸收緩慢，作用持續(xù)時間延長，在控制血糖的同時能減 少低血糖的風(fēng)險。
[0003] 在胰島素的發(fā)展史中，制備型高效液相技術(shù)的引入為胰島素質(zhì)量的提升起到十 分關(guān)鍵的作用，使得從動物中提取的胰島素和利用基因重組技術(shù)制備的人胰島素的純度 從90 %左右提升到98 %甚至更尚，包括脫氣廣物在內(nèi)的性質(zhì)與膜島素十分接近的相關(guān)物 質(zhì)的含量也得到很好的控制，胰島素的安全性進一步得到保障。目前主要的色譜純化工 藝有兩種：一是通過選用有機聚合物填料進行胰島素或胰島素類似物的純化，如中國專利 CN103275210A中采用Source15RPC、Source30RPC有機聚合物填料，在洗脫液pH2-4環(huán) 境下可有效的對一種脂肪酸單酰化胰島素進行純化，純化后樣品純度可達到98%，樣品收 率為71. 9% ;二是通過選用高級硅膠載體填料進行胰島素或胰島素類似物的純化，如中國 專利CN1171742A中采用C4填料在50mm制備柱上進行?；笠葝u素的純化，純化后樣品純 度未知，樣品收率為40. 2%。
[0004] 有機聚合物填料一般采用中低壓設(shè)備，而高級硅膠載體一般采用高壓層析設(shè)備。 比較來看，雖然采用有機聚合物填料進行純化的設(shè)備維護成本較低，但是具有許多明顯的 缺點：第一，有機聚合物填料的粒徑（一般在30微米以上，大至幾百微米）比普通高級 硅膠載體填料粒徑（一般在5-20微米之間）大很多，由于介質(zhì)自身的耐壓性能差，裝柱 過程承壓能力有限，裝填好的柱子內(nèi)部介質(zhì)不會致密均勻，測定的理論塔板數(shù)一般不會超 過20000,新裝填的層析柱柱效不高，從而導(dǎo)致樣品分離度較低，純化后樣品純度較難達到 98%以上且收率較低，這將明顯增加產(chǎn)品的生產(chǎn)成本；第二，有機聚合物填料粒徑一般在 5-300ym之間，顆粒均一度較差，耐壓性較低，在裝填層析柱和純化過程中都會造成填料的 破碎，從而導(dǎo)致層析柱內(nèi)部產(chǎn)生塌陷造成柱效下降，分離度降低，進一步造成收率下降。
[0005] 相比來看，高級硅膠載體填料裝填的柱子，柱效一般可以達到40000以上，且填料 能夠耐受lOMPa壓力，不易碎，長期純化試驗后柱效較穩(wěn)定，不會降低；且在較高的耐受壓 力下，純化過程中的線性流速可以更高，可做到對胰島素類似物的快速純化，更好的避免在 色譜純化過程中目的產(chǎn)物發(fā)生不利反應(yīng)，如脫氨反應(yīng)等，從而影響樣品純度和收率。
[0006] 因此，建立一種方法簡捷，產(chǎn)品的純度及收率高，具有較強的可放大性、適合作為 工業(yè)化純化?；葝u素或其類似物的色譜純化方法，將具有重要的價值和應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種酰化胰島素的色譜純化方法，該方法可一 步將粗樣品的純度由50-60%提高至99. 0%以上，且純化后樣品收率穩(wěn)定在90%以上，具 有較強的可放大性、適合作為工業(yè)化純化?；葝u素或其類似物的色譜純化方法。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明首先公開了一種?；葝u素的色譜純化方法，包括以下步驟：（1)以高級 硅膠載體作為層析填料，將色譜柱用平衡液進行平衡，將待純化的?；葝u素粗品上樣，用 平衡液平衡色譜柱；（2)用洗脫用流動相進行洗脫，收集主峰，得到目的產(chǎn)物?；葝u素純 品；其中，洗脫用流動相包括A相和B相；所述洗脫用流動相A相的pH為6. 5-8. 0,優(yōu)選的， 所述洗脫用流動相A相的pH為7. 0-8. 0,最優(yōu)選為pH7. 0。
[0010] 其中，所述A相為磷酸鹽緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷 緩沖液、硼酸_硼砂緩沖液中的任意一種或多種，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明通過調(diào)節(jié)磷 酸鹽緩沖液中磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉的比例，達到A相所述pH;或者通過加入鹽酸或者 氫氧化鈉調(diào)節(jié)A相的pH值。
[0011] 所述B相包括有機溶劑和水；其中所述有機溶劑為乙腈或碳原子數(shù)為C1-C4的醇 中的任意一種或多種，優(yōu)選為乙腈或乙醇；更優(yōu)選的，所述B相由乙腈和水按體積比9 :1組 成；或者，由乙醇和水按體積比9 :1組成。
[0012] 本發(fā)明色譜純化方法，步驟⑴所述高級硅膠載體（即層析填料）的配基為C4-C18的烷烴，優(yōu)選為C8烷烴；其中，所述配基是在高級硅膠載體的表面所鍵合的烷烴。本 發(fā)明所述高級硅膠載體填料的裝填壓力為7-10MPa。所述層析填料的平均粒度為5-30ym， 優(yōu)選為5-10ym。填料粒度越小，柱效越高，樣品純化分離度越高。步驟（1)所述平衡液包 括A相和B相，與洗脫用流動相中的A相和B相相同；按照體積比計，步驟（1)所述平衡液 由75% -90%的A相和10% -25%的B相組成，優(yōu)選為由80%的A相和20%的B相組成。
[0013] 按照體積比計，步驟⑵所述洗脫用流動相由50 % -60 %的A相和40 % -50 %的 B相組成，優(yōu)選為由55%的A相和45%的B相組成。步驟（2)所述洗脫的方式為等度洗脫 方式（即在洗脫過程中A相與B相的比例不變）或者線性梯度洗脫方式的任意一種。
[0014] 本發(fā)明考察了層析填料的不同配基對酰化胰島素分離效果的影響，結(jié)果表明C4、C8、C18三種配基都可以達到較好的純化效果，純化后樣品純度達97. 89% -99. 28%，純化 收率為85. 5% -91. 5% ;其中C8配基對于?；葝u素的純化效果優(yōu)于另外兩種填料配基， 且具有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性差異。
[0015] 本發(fā)明進一步考察A相不同的pH洗脫條件下對樣品分離效果的影響，結(jié)果表明， 在A相偏堿性（pH7. 5)的洗脫條件下對目的蛋白的純化效果明顯好于偏酸性（pH3. 5)洗脫 條件，純化后樣品純度更高，達99. 25%，且純化收率也更高，達90. 9 %。因此，本發(fā)明認(rèn)為 對于采用高級硅膠載體填料純化?；葝u素，采用偏堿性的洗脫條件更容易得到純度和收 率都更高的樣品。同時，本發(fā)明圍繞A相pH7. 5的洗脫條件對pH條件又進行優(yōu)化，結(jié)果表 明當(dāng)A相pH6. 5至8. 0時，目的蛋白純化后的純度和收率都較高，分別達98. 89% -99. 55% 和88. 1 % -93. 9%，尤其當(dāng)A相pH為7. 0時，洗脫下來的目的蛋白純度最高，且純化收率也 最尚。
[0016] 本領(lǐng)域一般認(rèn)為高級硅膠載體填料在酸性洗脫條件下可以達到最好的純化效果。 中國專利CN1313866A公開了采用高級硅膠載體填料在酸性（pH3. 5)洗脫條件下可以達到 最好的純化效果，純化后樣品純度大于98. 5%，產(chǎn)率68% ;而采用有機聚合物為固定相，在 堿性（PH9.0)條件下洗脫，純化后樣品純度大于98. 5%，產(chǎn)率64%-73%。采用色譜的方式 純化酰化胰島素粗品時，當(dāng)純度達到98%以上時，在不影響收率的前提下，即使將純度提高 〇. 5個百分點也是十分困難的。與已公開的相關(guān)中國專利在主要工藝參數(shù)及純化效果相比 較，本發(fā)明?；葝u素的色譜純化方法，通過采用高級硅膠載體填料（配基為C4-C18的烷 烴的反相硅膠填料），在堿性（pH6. 5-8.0)洗脫液環(huán)境下，可一步將酰化后粗樣的純度由 50-60%提高至99. 0%以上且純化后樣品收率穩(wěn)定在90%以上，純化后樣品純度和收率都 遠高于現(xiàn)有技術(shù)所獲得的成果。另外，本發(fā)明粗樣樣品的上樣量大，超過16克/升床層體 積，遠大于已公開的專利或技術(shù)中提到的胰島素類似物色譜純化上樣量；色譜純化過程中 線性流速高達250cm/h，可做到對胰島素類似物的快速純化。
[0017] 本發(fā)明所述待純化樣品是由去B30的人胰島素（即將人胰島素B鏈上天然排列在 第30位的蘇氨酸去掉）和選自以下任意一種的脂肪酸酯反應(yīng)制得的?；葝u素溶液：棕櫚 酸N-琥珀酰亞胺基酯、辛酸N-琥珀酰亞胺基酯或肉豆蔻酸N-琥珀酰亞胺基酯。反應(yīng)后的 目的產(chǎn)物（即?；葝u素）為脂肪酸酯與去B30的人胰島素的B29_Lys的e-氨基反應(yīng)并 以酰胺鍵相連形成的產(chǎn)物，同時在反應(yīng)溶液中還存在許多雜質(zhì)，如非目的位點修飾的產(chǎn)物 和未完全反應(yīng)的原料（脂肪酸酯與去B30的人胰島素）等。人胰島素是由51個氨基酸組 成的酸性小分子蛋白質(zhì)，分子式為C257H3S3N65077S6,分子量5807. 69。而本發(fā)明所述人胰島素 包括：有機合成的人胰島素或通過基因工程制備的重組人胰島素；其中，有機合成的人胰 島素是根據(jù)人胰島素的結(jié)