一種新型融合蛋白、藥物組合物及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種融合蛋白，具體涉及的是一種抑制腫瘤生長(zhǎng)的新型融合蛋白及藥 物組合物及該新型融合蛋白的制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫逃逸是腫瘤的惡化進(jìn)程中非常重要的一步。腫瘤細(xì)胞通過避免人體免疫系 統(tǒng)的殺傷作用得以快速生長(zhǎng)，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生。T細(xì)胞表面重要的負(fù)調(diào)節(jié)分子ro-i、 CTLA-4和HM-3均能夠抑制癌癥發(fā)生過程中T細(xì)胞的免疫殺傷作用。目前，臨床上已有針 對(duì)H)-l和CTLA-4靶點(diǎn)的藥物，這些藥物在臨床上治療效果非常顯著。
[0003] 程序細(xì)胞死亡1 (PD-1)受體主要在激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá)，其主要功能是 抑制免疫系統(tǒng)細(xì)胞的激活，這也是免疫系統(tǒng)一種正常的自穩(wěn)機(jī)制，因過度的T/B細(xì)胞激活 會(huì)引起自身免疫病，所以ro-i是我們?nèi)梭w的一道護(hù)身符。在病理情況下，腫瘤微環(huán)境會(huì)誘 導(dǎo)浸潤(rùn)的T細(xì)胞高表達(dá)ro-i分子，腫瘤細(xì)胞會(huì)高表達(dá)ro-i的配體ro-Li和ro-L2,導(dǎo)致腫 瘤微環(huán)境中ro-i信號(hào)通路持續(xù)激活，t細(xì)胞功能被抑制，無法殺傷腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致癌癥 的產(chǎn)生。阻斷這一信號(hào)通路的ro-i抗體可部分恢復(fù)t細(xì)胞的功能，使t細(xì)胞能夠繼續(xù)殺傷 腫瘤細(xì)胞。目前針對(duì)ro-l的抗體已有兩個(gè)藥物上市，分別是Nivolumab和Pembrolizumab， 二者在臨床上對(duì)多種癌癥均表現(xiàn)出顯著的治療效果。
[0004]VEGF-A是腫瘤細(xì)胞表達(dá)的一類促血管新生的生成因子，它的主要作用是提供免 疫抑制的微環(huán)境，為腫瘤細(xì)胞的增殖和癌癥的發(fā)生創(chuàng)造有利條件。科學(xué)家MagaliTerme (MagaliT，ThibaultV，etal, 2015,J.Exp.Med. 212:139-148)研究發(fā)現(xiàn)VEGF-A營(yíng)造 的腫瘤微環(huán)境能夠引起CD8+T細(xì)胞表面H)-l分子的上調(diào)，從而引起CD8+T細(xì)胞的免疫殺傷 作用降低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)VEGF-A的刺激能夠引起HM-3,CTLA-4,LAG-3等抑制分子的表達(dá)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中已有利用VEGF-A抗體和H)-l抗體作用治療腫瘤的報(bào)道，臨床應(yīng)用中 常常是單獨(dú)使用其中一種抗體或同時(shí)使用兩種抗體對(duì)腫瘤進(jìn)行治療，當(dāng)同時(shí)采用上述兩種 抗體進(jìn)行治療時(shí)則需要每天多次注射給藥，不僅給操作者帶來不便，而且給受試者也帶來 更多痛苦。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中VEGF-Trap和H)-l抗體在臨床應(yīng)用中需要每 天多次注射給藥的問題，提供既具有VEGF TRAP和H)-l抗體生理活性，又具有長(zhǎng)效功能的 一種新型融合蛋白，并公開了該新型融合蛋白組成的藥物組合物及該新型融合蛋白的制備 方法和用途。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種新型的融合蛋白，其結(jié)構(gòu)通式如下： X-連接肽-Y-連接肽-IgGFc片段或Y-連接肽-X-連接肽-IgGFc片段； 其中，X為VEGF-Trap及其衍生物；Y為H)-l抗體片段及其衍生物或者H)-l拮抗劑片 段及其衍生物。
[0008] 本發(fā)明并不是簡(jiǎn)單的將兩種抗體蛋白混合，而是采用兩種抗體進(jìn)行融合后組成一 種新型的融合蛋白，該蛋白能同時(shí)抑制H)-l和VEGF-A的活性，從而既能抑制腫瘤血管的新 生，又能雙重抑制ro-1的產(chǎn)生和活性，多條途徑激活t細(xì)胞；其具有既能饑餓腫瘤細(xì)胞，又 能激活T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。
[0009] 本發(fā)明對(duì)單獨(dú)使用ro-1抗體和VEGF-A抗體，組合使用ro-1抗體和VEGF-A抗體， 以及使用H)-l抗體和VEGF-A抗體結(jié)合的融合蛋白VNI的效果進(jìn)行小鼠內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況檢 測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表7和圖3所示。通過表7可知：采用本發(fā)明的新型融合蛋白，其不僅僅能 同時(shí)具有兩種抗體分別饑餓腫瘤細(xì)胞、以及激活T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，而且還能達(dá) 到兩種功能的協(xié)同促進(jìn)作用，使抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能更加顯著；并且，通過圖3所示，采用 本發(fā)明的新型融合蛋白還具有有效延長(zhǎng)各抗體單元生理活性功能效果的作用。
[0010] 優(yōu)選地，所述連接肽為式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n所示的氨基酸序列，該n是 1~4的整數(shù)。所述X的氨基酸序列為SEQIDN0 :1或SEQIDN0 :3,或其核苷酸編碼序列 為SEQIDN0 :2 或SEQIDN0 :4。所述Y的氨基酸序列為SEQIDN0 :5 或SEQIDN0 :7， 或其核苷酸編碼序列為SEQIDN0:6或SEQIDN0:8。所述IgGFc片段為IgGlFc片段、 IgG2Fc片段、IgG3Fc片段或IgG4Fc片段，其氨基酸序列分別為SEQIDN0:9、ll、13、15， 或其核苷酸編碼序列分別為SEQIDNO:10、12、14、16。
[0011] -種制備新型融合蛋白的方法，將權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述新型融合蛋白的編碼 核苷酸序列插入表達(dá)載體中，并將此表達(dá)載體引入相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)而進(jìn)行融合蛋白的表 達(dá)。本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)載體可以是重組真核表達(dá)載體，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體；也 可以是重組病毒表達(dá)載體，優(yōu)選腺相關(guān)病毒或腺病毒載體。
[0012] 上述表達(dá)系統(tǒng)中融合蛋白的宿主細(xì)胞，可以為CH0細(xì)胞及其亞系或293細(xì)胞及其 亞系。
[0013] -種藥物組合物，由權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的新型融合蛋白與藥學(xué)上可接受的 載體或賦形劑組成。
[0014] 進(jìn)一步，所述藥物組合物的制劑形式為注射劑、注射用凍干粉針。
[0015] -種新型融合蛋白的用途，所述權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的新型融合蛋白用于腫 瘤的治療；所述腫瘤為黑色素瘤、肺癌、肝癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸 癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌和前列腺癌中的一 種或多種。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果： 1、 本發(fā)明的融合蛋白不僅能同時(shí)具有兩種抗體分別饑餓腫瘤細(xì)胞、以及激活T細(xì)胞殺 傷腫瘤細(xì)胞的功能，而且還能達(dá)到兩種功能的協(xié)同促進(jìn)作用，使抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能更加 顯著； 2、 本發(fā)明的新型融合蛋白能有效延長(zhǎng)各抗體單元生理活性功能效果，進(jìn)而減少一個(gè)療 程的總用藥量，減少用藥成本； 3、 本發(fā)明可有效減少注射給藥的次數(shù)，減輕給藥痛苦。
【附圖說明】
[0017] 圖1為VNI對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖影響的EC50值曲線示意圖。
[0018] 圖2為VNI刺激PBMC產(chǎn)生IFNy的曲線示意圖。
[0019] 圖3為鼠源VNI在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的對(duì)比情況示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0021] 實(shí)施例1蛋白制備 一種新型融合蛋白，其結(jié)構(gòu)通式如下： X-連接肽-Y-連接肽-IgG Fc片段；其中，X為VEGF-Trap及其衍生物；Y為H)-l抗體 片段及其衍生物或者ro-i拮抗劑片段及其衍生物。
[0022] 本實(shí)施例中該X為VEGF-Trap，其核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示；Y為H)-l抗體 片段，其核苷酸序列如SEQIDN0 :6所示；所述連接肽為式（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n所示 的氨基酸序列，該連接肽中n為3;IgGFc片段的核苷酸序列如SEQIDN0:16所示；S卩，本 實(shí)施例中合成融合蛋白的基因片段核苷酸序列如SEQIDN0 :18所示。
[0023] 本實(shí)施例中上述新型融合蛋白的具體合成路線如下： 1.構(gòu)建重組質(zhì)粒 1. 1按照X-連接肽-Y-連接肽-IgGFc片段或Y-連接肽-X-連接肽-IgGFc片段的 通式，得到合成融合蛋白的基因片段和引物，并將合成融合蛋白的基因片段和引物重組至 質(zhì)粒載體puc57中獲得puc57-VNI質(zhì)粒。該合成融合蛋白的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO :13所示，該基因和引物由專業(yè)公司北京金唯智公司合成。
[0024] 1. 2將puc57-VNI質(zhì)粒和pCHOl. 0質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切處理，該酶切體系的建立： 在1.5mlEP管中加入如下成分：pCHOl.O質(zhì)?；騪uc57-VNI質(zhì)粒40yl，Buffer4 10yl，AvrII和BstZ17I各5yl，滅菌水45yl，混勻后在37°C下反應(yīng)5h，利用QIAGEN產(chǎn) 物純化試劑盒回收，分別獲得基因片段PCH01. 0和VNI。
[0025] 1. 3在T4連接酶的作用下，將已用相同酶切后回收獲得的基因片段pCHOl. 0和 VNI基因片段連接；連接反應(yīng)體系如下： 在 1.5mlEP管中加入如下成分 2yl的pCH01.0,6yl的VNI，10XT4Buffer1y1，1y1的T4DNA連接酶，混勻后在室溫（20°C左右）下反應(yīng)4h以上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 ToplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于2YT(KANA)平板培養(yǎng)基上37°C靜置過夜，平板編號(hào) pCHOl. 0-VNIo
[0026] 1. 4從pCHOl.0-VNI平板中各挑取數(shù)個(gè)重組單菌落經(jīng)過培養(yǎng)后做為PCR模板，分別 進(jìn)行PCR篩選鑒定； 菌液PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（總體積20 y L) :2 X TaqHS10 y L、菌液模板2 y L、上下游引 物P1和P2各1 y L(終濃度0. 3 y mol/L)，最后用雙蒸水補(bǔ)至20 y L;反應(yīng)條件：95°C 2min， 一個(gè)循環(huán)；94°C 60s、53°C 60s、72°C 120s，30個(gè)循環(huán)；最后72°C 5min。通過瓊脂糖凝膠電 泳分析結(jié)果，選取出具有目標(biāo)產(chǎn)物的正確菌落。
[0027] 1. 5通過PCR篩選鑒定的菌落接種后提取再分別進(jìn)行酶切鑒定；即首先進(jìn)行重組 菌的質(zhì)粒提取，然后進(jìn)行酶切分析； 酶切體系：在1.5mlEP管中加入如下成分：質(zhì)粒2yl，Bufferllyl，BSA0.lyl， AvrII和BstZ17I各1y1，補(bǔ)滅菌水至10y1，混勻后在37°C下反應(yīng)4h。通過瓊脂糖凝膠電 泳分析結(jié)果，選取出酶切鑒定正確的菌落。
[0028] 1. 6將通過菌落PCR和酶切鑒定正確的菌落隨機(jī)接種數(shù)個(gè)菌落再進(jìn)行測(cè)序鑒定， 選取出表達(dá)質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞篩選 采用宿主細(xì)胞CH0-S或DG44,按照FreedomCHO-SKit試劑盒說明書分別進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)胞分別置于搖瓶培養(yǎng)8h，搖瓶培養(yǎng)的條件為：37°C、8%C02、110rpm/min。通 過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞活率和細(xì)胞數(shù)。
[0030] 轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行兩步加壓篩選：10P/100M，20P/200M(P=10yg/mLPuromycin，M=nM MTX) ;30P/500M，50P/1000M，獲得初篩細(xì)胞。以有限稀釋法進(jìn)行單克隆細(xì)胞篩選，通過檢測(cè) 蛋白表達(dá)量以及純度從中優(yōu)選克隆逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0031] 3?蛋白表達(dá)和純化 篩選高產(chǎn)克隆細(xì)胞從96孔板擴(kuò)至24孔板生長(zhǎng)，然后擴(kuò)至6孔板生長(zhǎng)，之后擴(kuò)至50mL搖瓶生長(zhǎng)。
[0032] 收集培養(yǎng)7天細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心除去細(xì)胞碎片，上清液以0. 45ym濾膜過 濾，調(diào)節(jié)口^1至7.4，用蛋白八瓊脂糖親和柱層析（11；[1'抑口？1'(^6；[11-六36口1^1'086 3€；1^11；^7 column)純化融合蛋白，5倍柱床體積的去離子水沖洗柱子，再用5倍柱床體積