且固液比為1:10，攪拌4 h，靜置24 h后，離心得到上清液2和土壤殘?jiān)?br> 氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上清液2中加入6mol/L鹽酸，使其pH =1.0，攪拌30 min，靜置24h后，離心得固體，標(biāo)記為腐殖酸2 ;
步驟d、腐殖酸除硅:將腐殖酸I和腐殖酸2合并，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，用含有0.1 mol/L氫氧化鈉和0.3 mol/L氯化鈉的溶液溶解，高速離心分離，得到上層清液；將該上層清液用鹽酸酸化至PH=L 0，攪拌30min，靜置24 h，離心得固體，標(biāo)記為腐殖酸3 ;
向腐殖酸3中加入含有0.lmol/L鹽酸和0.3 mol/L氫氟酸的溶液，使其固液比為1:10，持續(xù)攪拌24 h，高速離心分離得固體標(biāo)記為無硅腐殖酸；
步驟e、土壤腐殖酸除雜酸:向無硅腐殖酸中加入0.lmol/L鹽酸溶液，使其固液比為
1:10，持續(xù)攪拌4h，并靜置24 h后，離心得到上層清液及純化腐殖酸；
步驟f、土壤腐殖酸的亞組分分級(jí):在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，用氫氧化鈉將步驟e中的純化腐殖酸溶解，加入去離子水使溶液中腐殖酸濃度在1-3 g/L，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH=2后，以10倍柱體積/h的速度流過XAD-8樹脂柱，流出液棄去；
以10柱體積/h的速度，用pH=3的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2_50ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=3的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至pH =1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH3 ;
以10柱體積/h的速度，用pH =4的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2_50ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=4的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH =1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸pH4 ；
以10柱體積/h的速度，用pH =5的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2_50ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=5的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH5 ;
以10柱體積/h的速度，用pH =6的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2_50ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=6的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸
PH6 ;
以10柱體積/h的速度，用pH =7的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2_50ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=7的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH7 ;
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以10柱體積/h的速度，用pH =8的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=8的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸pH8 ；
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以10柱體積/h的速度，用pH =9的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=9的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸pH9 ；
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以10柱體積/h的速度，用pH =10的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=10的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH =1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸pH1 ；
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以10柱體積/h的速度，用pH =11的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止PH=Il的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH =1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸pHll ；
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以10柱體積/h的速度，用pH =12的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=12的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH =1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸pH12 ；
氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以10柱體積/h的速度，用pH =13的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2-50 ml流出液，用特定波長(zhǎng)紫外/可見光進(jìn)行測(cè)定，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=13的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH =1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸pH13 ；
步驟g、土壤腐殖酸除鹽及固化:在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，用0.1-0.3 mol/L的氫氧化鈉分別溶解腐殖酸PH3-腐殖酸pH13，使每份溶液固液體積比均為1:2，用濃鹽酸分別調(diào)節(jié)溶液pH=4-9，共計(jì)得到11份腐殖酸亞組分溶液；
將11份腐殖酸亞組分溶液分別置入11個(gè)截留分子量為10000道爾頓透析袋，并將每個(gè)透析袋置于超純水中，組成透析體系，攪拌24 h，鹽分通過透析袋進(jìn)入超純水，將每個(gè)透析袋中的腐殖酸亞組分溶液冷凍干燥得到11份腐殖酸亞組分，命名為腐殖酸亞組分PH3-pH13o
[0015]優(yōu)選的，所述分級(jí)提取方法中，所述步驟e中所得上層清液用溶解有機(jī)碳測(cè)定儀器測(cè)定其溶解有機(jī)碳含量，如果上清液中溶解有機(jī)碳T0C> 5mg/L，則重復(fù)步驟e，直到T0C<5 mg/L后，再進(jìn)行步驟f。
[0016]優(yōu)選的，所述步驟g中透析體系攪拌20— 40 h后，用鉬酸銨分光光度法和硝酸銀法測(cè)定g中透析袋外溶液的磷含量和氯離子含量，如果總磷含量>0.01 mg/L或者有氯化銀存在，則多次更換透析體系中的超純水，每次加入去離子水，攪拌20—40 h后，再次測(cè)定，直到磷含量〈0.01 mg/L且檢測(cè)不到氯離子。本發(fā)明中所述的鉬酸銨分光光度法可采用GB11893-89中規(guī)定的方法。
[0017]優(yōu)選的，所述分級(jí)提取方法還包括步驟h:在80-100°C下烘干20_40h后，在550°C下灼燒5-10h，測(cè)定步驟g所得的11份腐殖酸亞組分腐殖酸pH3- pH13的灰分；
如果某腐殖酸亞組分以干重計(jì)灰分大于1.0%，則將該腐殖酸亞組分在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，在容器中，用氫氧化鈉溶解，加入去離子水使溶液腐殖酸濃度=1 一3 g/L后，調(diào)節(jié)pH=3-9 ;加入濃鹽酸、濃氫氟酸和去離子水，使其固液比為1:10且鹽酸濃度為0.lmol/L，氫氟酸濃度為0.3mol/L，持續(xù)攪拌20-28 h，離心分離得固體后重復(fù)操作步驟g。優(yōu)選的，容器可采用塑料容器。
[0018]本發(fā)明中步驟b完成對(duì)土壤的酸洗，去除了酸溶性鈣鎂離子，減少了鈣鎂離子對(duì)焦磷酸鈉和氫氧化鈉提取過程的影響，增加了腐殖酸的暴露；
步驟c再連續(xù)用焦磷酸鈉和氫氧化鈉提取腐殖酸和富里酸亞組分，將鈣、鎂、鋁、鐵等結(jié)合的腐殖酸與富里酸亞組分溶出； 步驟d使用高速離心法和氫氟酸去除硅酸鹽。步驟e利用pH=l.0條件下，富里酸溶解而腐殖酸沉淀的特點(diǎn)，用酸洗腐殖酸方法，去除富里酸；
步驟f利用不同腐殖酸組分在XAD-8樹脂上的吸附差異，進(jìn)行亞組分分級(jí)；
步驟g為腐殖酸亞組分的除鹽分和固化過程。
[0019]本發(fā)明中步驟b中，利用在pH=l.0的條件下，腐殖酸為固態(tài)，部分雜質(zhì)(如富里酸、鈣鎂離子)等雜質(zhì)可溶等特點(diǎn)，對(duì)土壤和腐殖酸進(jìn)行酸洗，具有以下優(yōu)點(diǎn):1)ρΗ=1.0時(shí)，腐殖酸為沉淀，土壤酸洗過程中不會(huì)損失土壤中腐殖酸；2) pH=l.0時(shí)，富里酸可溶，去除部分酸溶性富里酸；3) pH=l.0條件下，能夠去除酸溶性鈣鎂離子，減少了鈣鎂對(duì)焦磷酸鈉和氫氧化鈉的干擾；4)鹽酸與土壤礦物中的鐵、鋁、錳反應(yīng)，減少自由態(tài)和酸溶性鐵、鋁、錳離子濃度，降低鐵、鋁、錳對(duì)焦磷酸鈉和氫氧化鈉提取過程的影響；5)酸洗后，部分腐殖酸進(jìn)一步暴露出來。
[0020]本發(fā)明中步驟c利用焦磷酸鈉和氫氧化鈉提取土壤中腐殖酸。由于在此之前，溶液中加入的有鹽酸(土壤酸洗)，自由態(tài)和酸溶態(tài)金屬離子已經(jīng)去除，在酸性條件下土壤中的腐殖酸亞組分進(jìn)一步暴露，故焦磷酸鈉主要與有機(jī)質(zhì)結(jié)合態(tài)鈣、鎂、鐵、鋁等反應(yīng)，涉及主要反應(yīng)有:
2[R (COO) ] 2Ca+Na4P207— R (COONa) 4+Ca2P207 (沉淀)
4 [R (COO) ] 3Fe+3Na4P207— 3R (COONa) 4+Fe4 (P2O7) 3 (沉淀)
4[R (COO) ] 3Al+3Na4P207— 3R (COONa) 4+Al4 (P2O7) 3 (沉淀)
由于土壤酸洗過程除去部分鈣、鎂、鐵、鋁，加入焦磷酸鈉后產(chǎn)生的沉淀焦磷酸鈣、焦磷酸鐵、焦磷酸鋁等不會(huì)將富里酸亞組分包裹起來，從而利于腐殖酸亞組分的提取。
[0021]R(COOH) +NaOHA(COONa)+H20
土壤酸洗過程除去部分鈣、鎂、鐵、鋁，加入焦磷酸鈉后產(chǎn)生的沉淀氫氧化鈣、氫氧化鐵、氫氧化鋁等不會(huì)將腐殖酸包裹起來，從而利于腐殖酸的提取。
[0022]本發(fā)明步驟d中將用含有0.lmol/L氫氧化鈉和0.3 mol/L氯化鈉的溶液溶解腐殖酸后，高速離心分離，是為了去除堿不溶的腐殖酸雜質(zhì)；
本發(fā)明步驟d中加入氫氟酸的操作是:利用氫氟酸和硅酸鹽及硅單質(zhì)反應(yīng)，生產(chǎn)四氟合硅氣體，從而去除富里酸亞組分樣品中的含硅雜質(zhì)。
[0023]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明土壤中腐殖酸的分級(jí)提取方法能夠克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)腐殖酸分級(jí)提取過程的不足，獲得純度較高的腐殖酸各級(jí)亞組分，便于對(duì)土壤的研究。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。
[0025]實(shí)施例1:北京郊區(qū)森林土壤中富里酸的提取:
于2013年6月份取北京郊區(qū)森林土壤樣品，土壤中含有大量植物根莖，石子、和土壤微生物等；
XAD-8樹脂柱；Sigma公司；
氫氧化鈉:分析純；鹽酸:分析純；
本實(shí)施例的具體提取步驟如下: 一種土壤中腐殖酸的分級(jí)提取方法，所述分級(jí)提取方法包括如下步驟:
步驟a、土壤預(yù)處理:稱取天然土壤，剔除樹根和石子等雜物，風(fēng)干碾磨后過2.0 mm的篩，得到土壤樣品；
步驟b、土壤酸洗:向1000g 土壤樣品中加入去離子水50 L，使固液比達(dá)到1:5，用6mol/L氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)其pH=l.0，得到固液混合物，向該固液混合物中加0.lmol/L的鹽酸溶液，使其固液比為1:10，連續(xù)攪拌4 h，靜置24 h后，離心后棄去上清液，得到酸洗土壤樣品；
步驟c、提取土壤中腐殖酸:向酸洗土壤樣品中加入去離子水30 L，使其固液比為1:3，用6mol/L氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH=7，得到固液混合物，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向該固液混合物中加入0.2 mol/L焦磷酸鈉溶液50 L，并用去離子水稀釋，使焦磷酸鈉濃度為0.1mol/L且固液比為1:10，持續(xù)攪拌4h，靜置24 h后，離心得到100 L上清液I和土壤樣品I;
氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上清液I中加入6mol/L鹽酸，使其pH =1.0，攪拌30 min，靜置24后，離心得固體，標(biāo)記為腐殖酸1，濕重157 g ;
向步驟b中的土壤樣品I中加入30L去離子水，使其固液比為1:3，用6mol/L氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)其pH=7，得到固液混合物，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向該固液混合物中加入0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，并用去離子水稀釋，使氫氧化鈉濃度為0.1 mol/L且固液比為1:10，攪拌4h，靜置24 h后，離心得到上清液2和土壤殘?jiān)?br> 氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，向上清液2中加入6mol/L鹽酸，使其pH =1.0，攪拌30 min，靜置24h后，離心得固體，標(biāo)記為腐殖酸2，濕重239 g ；;
步驟d、腐殖酸除硅:將腐殖酸I和腐殖酸2合并，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，用含有0.1 mol/L氫氧化鈉和0.3 mol/L氯化鈉的溶液溶解，高速離心分離，得到上層清液；將該上層清液用2 mol/L鹽酸酸化至pH=1.0，攪拌30min，靜置24 h，離心得固體，標(biāo)記為腐殖酸3，濕重395 g ；
在塑料容器中，向腐殖酸3中加入含有用含有0.1 mol/L鹽酸和0.3 mol/L氫氟酸的溶液，使其固液比為1:10，持續(xù)攪拌24 h，離心分離得固體標(biāo)記為無硅腐殖酸，濕重395 g;
步驟e、腐殖酸除雜酸:向無硅腐殖酸中加入0.1 mol/L鹽酸溶液，使其固液比為1:10，持續(xù)攪拌4h，并靜置24 h后，離心得到上層清液及純化腐殖酸，濕重394 g ;
步驟f、土壤腐殖酸的亞組分分級(jí):在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，用0.1 mol/L氫氧化鈉將步驟e中的純化腐殖酸溶解，加入去離子水使溶液體積為100 L，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH=2.0后，以10柱體積/h的速度流過XAD-8樹脂柱，流出液棄去；
以10柱體積/h的速度，用pH =3的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集50 ml流出液，在650 nm處測(cè)定流出液吸光值，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=3的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液共計(jì)，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體，標(biāo)記為腐殖酸PH3 ;
以10柱體積/h的速度，用pH =4的焦磷酸鈉緩沖液淋洗XAD-8樹脂柱，每收集2_50ml流出液，在650 nm處測(cè)定流出液吸光值，流出液的紫外/可見吸光值先增大后減小，當(dāng)流出液紫外/可見吸光值小于最大吸光值的0.5%時(shí)，停止pH=4的焦磷酸鈉緩沖液淋洗過程，合并流出液，立即酸化至PH= 1，攪拌4 h后，靜置24h，離心得到固體