一種蘋果酸—乳酸細菌及其應用
【專利說明】一種蘋果酸一乳酸細菌及其應用
[0001] -、技術領域： 本發(fā)明涉及微生物技術領域，具體涉及一種蘋果酸一乳酸細菌及其應用。
[0002] 二、【背景技術】： 蘋果酸一乳酸發(fā)酵（MLF)是干紅葡萄酒生產必不可少的工序之一，目前，干紅葡萄酒生 產中進行蘋果酸一乳酸發(fā)酵通常有兩種方法，一是自然觸發(fā)，二是人工接種乳酸菌，但是迄 今國內還不能生產活性乳酸菌于粉，此類發(fā)酵劑全部依賴進口。究其原因在于葡萄酒生產 要求特殊的環(huán)境，大多數能夠進行蘋果酸一乳酸發(fā)酵的細菌很難在其中繁殖代謝。篩選出 適合中國葡萄酒生產的蘋果酸一乳酸細菌尤為迫切。
[0003] 三、
【發(fā)明內容】
： 本發(fā)明為了解決上述【背景技術】中的不足之處，提供一種蘋果酸一乳酸細菌及其應用， 其篩選出對不良環(huán)境抗性強、蘋果酸-乳酸酶活力高、釀酒特性好的優(yōu)良蘋果酸一乳酸細 菌。
[0004] 為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：一種蘋果酸一乳酸細菌，其特征在 于：所述的蘋果酸一乳酸細菌為酒酒球菌SD-lb，該菌株已于2014年4月2日保藏于中 國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為：CGMCCN0. 8988，。
[0005]所述的酒酒球菌SD-lb的培養(yǎng)方法為： 1) 在固體分離培養(yǎng)基中，在28-30°C和厭氧充氮氣條件下培養(yǎng)5-8天，得分離菌株； 2) 對步驟1)分離獲得的菌株在液體培養(yǎng)基中進行菌種擴大，液體培養(yǎng)25-28°C，靜置， 在培養(yǎng)菌到對數期末時進行離心收集菌體，離心轉速為lOOOrpm; 所述的固體分離培養(yǎng)基為改良ATB培養(yǎng)基或改良MRS培養(yǎng)基。
[0006] 所述的改良ATB培養(yǎng)基：ATB培養(yǎng)基+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬占霉素。
[0007] 所述的改良MRS培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬 古霉素。
[0008] 所述的ATB培養(yǎng)基的配方為：ATB培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，葡萄 糖l〇g，硫酸鎂〇? 2g，硫酸錳0? 05g，鹽酸半胱氨酸0? 5g，1MHCL或NaOH調pH至4. 8。
[0009] 所述的MRS培養(yǎng)基的配方為：MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/ L萬古霉素。
[0010] 酒酒球菌SD-lb的分離方法為：在上述固體分離培養(yǎng)基即ATB培養(yǎng)基+ 50mg/L放 線菌酮+50mg/L萬古霉素或MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬古霉 素上，采用涂布分離法對蘋果酸-乳酸細菌進行分離，取樣量為0.lml，培養(yǎng)溫度為28°C， 在厭氧箱中充N2培養(yǎng)5-7天，充N2的量應大于厭氧箱內剩余體積的95%。
[0011] -種酒酒球菌SD-lb在制備葡萄酒中的應用。
[0012] 與現有技術相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下：本發(fā)明酒酒球菌SD-lb對葡萄酒環(huán) 境適應性良好，可用于葡萄酒行業(yè)以及相關的食品行業(yè)。
[0013] 四、【附圖說明】： 圖1為本發(fā)明微生物在干紅葡萄酒生產中的應用步驟圖。
[0014] 五、【具體實施方式】： 一種蘋果酸一乳酸細菌，其特征在于：所述的蘋果酸一乳酸細菌為酒酒球菌SD-lb，該 菌株已于2014年4月2日保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為：CGMCCN0. 8988 〇
[0015] 所述的酒酒球菌SD-lb的培養(yǎng)方法為： 1) 在固體分離培養(yǎng)基中，在28-30°C和厭氧充氮氣條件下培養(yǎng)5-8天，得分離菌株； 2) 對步驟1)分離獲得的菌株在液體培養(yǎng)基中進行菌種擴大，液體培養(yǎng)25-28°C，靜置， 在培養(yǎng)菌到對數期末時進行離心收集菌體，離心轉速為lOOOrpm; 所述的固體分離培養(yǎng)基為改良ATB培養(yǎng)基或改良MRS培養(yǎng)基。
[0016] 所述的改良ATB培養(yǎng)基：ATB培養(yǎng)基+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬占霉素。
[0017] 所述的改良MRS培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬 古霉素。
[0018] 所述的ATB培養(yǎng)基的配方為：ATB培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，葡萄 糖l〇g，硫酸鎂〇? 2g，硫酸錳0? 05g，鹽酸半胱氨酸0? 5g，1MHCL或NaOH調pH至4. 8。
[0019] 所述的MRS培養(yǎng)基的配方為：MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/ L萬古霉素。
[0020] 酒酒球菌SD-lb的分離方法為：在上述分離培養(yǎng)基即ATB培養(yǎng)基+ 50mg/L放線 菌酮+50mg/L萬古霉素或MRS培養(yǎng)基+10%番茄汁+50mg/L放線菌酮+50mg/L萬古霉素 上，采用涂布分離法對蘋果酸-乳酸細菌進行分離，取樣量為0.lml，培養(yǎng)溫度為28°C，在 厭氧箱中充N2培養(yǎng)5-7天，充N2的量應大于厭氧箱內剩余體積的95%。
[0021] -種酒酒球菌SD-lb在制備葡萄酒中的應用。
[0022] 將蘋果酸-乳酸細菌(酒酒球菌SD-lb)進行pH、S02、酒精的抗性實驗：具體做法 是，首先進行pH、S02、酒精單因子實驗，然后進行復合實驗，篩選出對逆境抗性強的蘋果酸 -乳酸細菌(酒酒球菌SD-lb)。本發(fā)明所述的各種抗性實驗方法是本領域內技術人員公知 的方法。
[0023] 蘋果酸降解實驗：將篩選出的菌株按107cfu/ml的接種量接入添加有3g/L的L-蘋果酸ATB培養(yǎng)基中（pH4. 8)，每隔24h進行紙層析監(jiān)測，觀察蘋果酸斑點的變化，以蘋果酸 斑點消失時為蘋果酸分解完畢。
[0024] 蘋果酸-乳酸酶活力測定，表1為不同菌株蘋果酸一乳酸酶活比較：蘋果酸-乳酸酶活力的定義為：20°C條件下，在10ml的培養(yǎng)基中，蘋果酸-乳酸細菌(酒酒球菌 SD-lb)24h降解蘋果酸的毫克數與每毫升中活細胞數的對數值（logcfu/ml)的比值。試驗 證明，SD-lb的蘋果酸-乳酸酶活力優(yōu)于對照菌株31DH。
[0025] 釀酒適應性實驗（參見表2-表13):通過對蘋果酸-乳酸發(fā)酵速率、蘋果酸降解 率、揮發(fā)酸生成量、葡萄酒中有機酸、丹寧、總酚以及顏色發(fā)生的變化、酒體柔和指數發(fā)生的 改變以及氨基酸代謝對葡萄酒質量的影響等方面的綜合測定，結合品嘗分析，確定酒類酒 球菌（Oenococcusoeni)SD_lb為釀酒特性優(yōu)良的菌株，該菌株已于2014年4月2日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號，保藏號為：CGMCCN0. 8988,分類命名為：酒類酒球菌。
[0026] 表1不同菌株蘋果酸-乳酸酶活比較 TableIComparisonofMLAwithdifferentstrains
表4各菌株MLF酒樣揮發(fā)酸、總酸、pH比較 Table4Comparisonofvolatileacids,totalacidsandpHvaluesinwines afterMLFbydifferentstrains
表5不同菌株MLF酒樣中蘋果酸、乳