一種鞘脂菌(Sphingobium sp.)IBY及其在吸附降解疏水性有機(jī)物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY及其在 吸附降解疏水性有機(jī)物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌細(xì)胞的疏水相互作用是指疏水性較強(qiáng)的細(xì)胞能夠避開水而易與疏水性較強(qiáng) 的物質(zhì)發(fā)生作用。疏水性是決定細(xì)菌非特異性黏附到各種生物和非生物表面及界面的最重 要因素之一，也是影響細(xì)菌吸收和降解疏水性有機(jī)物的主要因素之一。在利用微生物降解 疏水性有機(jī)物的過程中，細(xì)胞表面疏水性影響細(xì)菌對(duì)污染物的黏附，能促進(jìn)細(xì)菌對(duì)疏水性 有機(jī)物的吸附和降解。
[0003] 結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性是菌體的表面性質(zhì)之一，也必定是菌體表面 結(jié)構(gòu)所決定的。研究表明，革蘭氏陰性菌的脂多糖和外膜蛋白與菌體表面疏水性具有一定 的關(guān)聯(lián)。鞘脂菌（Sphingobium)屬細(xì)菌屬于廣義上的鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas)，其細(xì) 胞膜組成不同于一般的革蘭氏陰性菌特有的脂多糖，而取而代之的是鞘糖脂，因此推測(cè)廣 義鞘氨醇單胞菌比其他革蘭氏陰性菌具有更強(qiáng)的細(xì)胞表面疏水性。
[0004] 雖然廣義鞘氨醇單胞菌被認(rèn)為比其他革蘭氏陰性菌具有更強(qiáng)的細(xì)胞表面疏水性， 但目前所報(bào)道的廣義鞘氨醇單胞菌都是親水菌，它們細(xì)胞表面疏水性都不高，仍不屬于疏 水細(xì)菌，而且細(xì)胞表面疏水性隨著細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)的不同而表現(xiàn)差異，并與培養(yǎng)過程添加的 碳源物質(zhì)和電子受體有關(guān)。一種性質(zhì)穩(wěn)定的真正意義上的疏水細(xì)菌的獲得，無疑將給疏水 性有機(jī)物的污染問題的解決帶來曙光。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種疏水鞘脂菌（Sphingobiumsp. )IBY，該細(xì)菌于 2015年7月1日保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，保 藏編號(hào)為CCTCCNO:M2015419。
[0006] 本發(fā)明的鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY是通過對(duì)廣東汕頭某電子垃圾集中處理 區(qū)的河床底泥進(jìn)行富集培養(yǎng)、分離、純化，得到Sphingobium屬的一個(gè)新種。
[0007] 鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的形態(tài)學(xué)和生理生化特征：該菌24h平板培養(yǎng)物菌 落圓形、黃色，突出培養(yǎng)基，透明，直徑0. 5-1. 0mm。菌體革蘭氏陰性，不形成芽孢，端生鞭毛。 菌體呈現(xiàn)長(zhǎng)1. 0-3. 0ym寬0. 6-0. 9ym的長(zhǎng)桿狀形態(tài)。氧化酶和過氧化氫酶陽(yáng)性。該菌能 在好氧和兼性厭氧條件下生長(zhǎng)，生長(zhǎng)pH4. 0~9. 0。
[0008] 鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的分子分類學(xué)地位：按照常規(guī)方法提取鞘脂菌 (Sphingobiumsp.)IBY的總DNA。采用16SrRNA通用引物8F和1492R利用高保真酶擴(kuò)增其 16SrRNA基因，將PCR產(chǎn)物連接T載體后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得其16SrRNA基因序 列，其序列如SEQIDNO. 1所示。將該序列與NCBI的GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行BLAST 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的16SrRNA基因序列與Sphingobium屬的 已有模式菌株具有較高的相似性，其中與SphingobiumxenophagumBN6的序列相似性為 99 %。再擴(kuò)增其gyrB基因，將PCR產(chǎn)物連接T載體后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得的gyrB基 因序列，其序列如SEQIDNO. 2所示。經(jīng)BLAST分析，其與SphingobiumxenophagumBN6相 似度為96 %。采用復(fù)性速率液相雜交法測(cè)得鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY與Sphingobium xenophagumBN6的全基因組DNA-DNA雜交率為54. 5%。
[0009] 鞘脂菌（Sphingobiumsp. )IBY的細(xì)胞表面疏水性：通過微生物黏著碳?xì)浠衔?(MATH)法測(cè)得該菌的細(xì)胞表面疏水性為58. 9%;水相接觸角測(cè)量（CAM)法測(cè)得該菌的水相 接觸角為60. 4°。上述兩種結(jié)果均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同屬親緣性最高的Sphingobiumxenophagum BN6,并且屬于疏水細(xì)菌范疇。
[0010] 綜合上述形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子分類學(xué)結(jié)果，認(rèn)為（Sphingobiumsp.)IBY 屬于Sphingobium屬的一個(gè)新種，于2015年7月1日保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，地址：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2015419。
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY在吸附降解疏水性有 機(jī)物中的應(yīng)用，優(yōu)選為在吸附降解多溴聯(lián)苯醚或苯系物中的應(yīng)用，更優(yōu)選的為在吸附降解 十溴二苯醚中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY具有很強(qiáng)的細(xì)胞表面疏水性，在純有機(jī)溶 劑十六烷烴中能較長(zhǎng)時(shí)間保持較高存活率，能有效地吸附十溴二苯醚、苯系多種疏水性有 機(jī)物，在疏水有機(jī)物（比如十溴二苯醚）為碳源的培養(yǎng)基中能較快降解多種疏水性有機(jī)污 染物。
[0013] 本發(fā)明提供了 一種具有降解疏水性有機(jī)物能力的疏水細(xì)菌新種一一鞘脂菌 (Sphingobiumsp.)IBY，為疏水性有機(jī)污染物的環(huán)境污染治理提供了有效的降解菌種資 源。
[0014] 本發(fā)明的Sphingobiumsp.IBY已于2015年7月1日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心（CCTCC)，地址：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2015419。
【附圖說明】
[0015] 圖1是鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY在水相/十六烷烴兩相系統(tǒng)中分離不同時(shí) 間的照片。圖中分別表示SphingobiumxenophagumBN6(B)和鞘脂菌（Sphingobiumsp.) IBY(Cl)在水相/十六烷烴兩相系統(tǒng)中20min和18h的存活情況。
[0016] 圖2是鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的水相接觸角照片。其中，B為Sphingobium xenophagumBN6的水相接觸角，Cl為鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的水相接觸角。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0018] 實(shí)施例1 :鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的分離和鑒定
[0019] 取20g廣東汕頭某電子垃圾集中處理區(qū)的河床底泥，加入80mL無菌水?dāng)噭虼蛏?后，過篩去掉植物殘?jiān)按箢w粒物；濾液再經(jīng)過2000Xg，常溫，離心2min，去掉小顆粒物； 得到的上清液經(jīng)過6000Xg，常溫，離心lOmin，收集沉淀物；沉淀物加入80mL無菌水，洗 滌、離心處理三次。最后獲得的沉淀物作為種源，接種到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中（Na2HP045. 7mM，KH2P043. 3mM，NH4C1 18.OmM，酵母抽提物0? 2g/L，0 _環(huán)糊精10mM)，培養(yǎng)基中同時(shí)加入1yM 的BDE209和2.8g/L的零價(jià)鐵粉。固體培養(yǎng)基中加入20g/L瓊脂。培養(yǎng)物置于30°C靜置避 光培養(yǎng)，每月經(jīng)過6000Xg，常溫，離心lOmin，收集沉淀物，重新轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 連續(xù)培養(yǎng)12個(gè)月以后，將富集培養(yǎng)物在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，得到單菌落。由此獲得菌 株IBY。
[0020] 將菌株IBY進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，其形態(tài)學(xué)和生理生化特征如下：該菌24h 平板培養(yǎng)物菌落圓形、黃色，突出培養(yǎng)基，透明，直徑〇. 5-1.Omm。菌體革蘭氏陰性，不形成芽 孢，端生鞭毛。菌體呈現(xiàn)長(zhǎng)1. 0-3. 0ym寬0. 6-0. 9ym的長(zhǎng)桿狀形態(tài)。氧化酶和過氧化氫 酶陽(yáng)性。該菌能在好氧和兼性厭氧條件下生長(zhǎng)，生長(zhǎng)pH4. 0~9. 0。
[0021] 按照常規(guī)方法提取菌株IBY的基因組總DNA。采用16SrRNA基因通用引物8F 和 1492R擴(kuò)增其 16SrRNA基因，8F:5' -AGAGTITGATCMTGGCTCAG-3'，M=A/C;1492R: 5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3'。選擇如下PCR反應(yīng)體系和程序：10XPCRbuffer5. 0yL， 10.Ommol/LdNTP1. 0yL，10.Opmol/uL8F引物 1. 0yL，10.Opmol/uL1492R引物 1. 0yL， lOng/uL基因組DNA1. 0yL，2. 5U/yL高保真Taq酶 0? 5yL，去離子水補(bǔ)足 50. 0yL。94°C 預(yù)變性5min后，94°C變性45s、56 °C退火45s、68 °C延伸1. 5min，30個(gè)反應(yīng)循環(huán)后，68 °C延伸 lOmin;擴(kuò)增其16SrRNA基因。將PCR產(chǎn)物連接T載體后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得的 16SrRNA基因序列，其序列如SEQIDNO. 1所示。將該序列與NCBI的GenBank中序列進(jìn)行 比對(duì)，進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株IBY的16SrRNA基因序列與Sphingobium屬的已有 模式菌株具有較高的相似性，其中與SphingobiumxenophagumBN6的序列相似性為99%。
[0022] 采用引物gyrB-U:5' -ATGAGCGASGAAMCCCAGAA-3'，S=C/G，M=A/C以及引 物gyrB-D:5' -GTCCAGATTGGCGACGTTC-3'，并選擇如下PCR反應(yīng)體系和程序：10XPCR buffer5. 0yL，10. 0mmol/LdNTP1. 0yL，10. 0pmol/uLgyrB-U引物 1. 0yL，10. 0pmol/uL gyrB-D引物 1. 0yL，lOng/uL基因組DNA1. 0yL，2. 5U/yL高保真Taq酶 0? 5yL，去離子水 補(bǔ)足50. 0yL。94°C預(yù)變性5min后，94°C變性45s、53°C退火45s、68°C延伸3min，30個(gè)反應(yīng) 循環(huán)后，68°C延伸lOmin;擴(kuò)增其gyrB基因。將PCR產(chǎn)物連接T載體后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè) 序，獲得的gyrB基因序列，其序列如SEQIDN0. 2所示。經(jīng)BLAST分析，其與Sphingobium xenophagumBN6 相似度為 96%。
[0023] 按照常規(guī)方法提取菌株IBY和BN6的基因組總DNA，測(cè)定DNA在A23Q、A26。和A28。波 長(zhǎng)的吸光值，若比值符合A23。：A26。：A2SQ= 1 : 0.450 : 0.515的比例關(guān)系，則進(jìn)行后續(xù)操 作，否則繼續(xù)純化DNA。將符合要求的DNA置于冰浴中40W超聲4次，每次15s。超聲剪切后 的DNA樣品用0. 1XSSC緩沖液配制成0D26。為1. 5~2. 0的DNA樣品。分別取IBY、BN6的 DNA樣品各500yL于兩個(gè)比色皿中，IBY、BN6各250yL混合裝于第三個(gè)比色皿中，置于相 應(yīng)樣品槽中。99°C變性lOmin，并用預(yù)熱的吸管吸取預(yù)熱的10XSSC緩沖液500yL加入變 性樣品中，混勾，在最適復(fù)性溫度71 °C復(fù)性30min，記錄吸光值0D26。，每隔5min記錄一次。采 用以下公式求得樣品IBY、BN6和混合樣品的復(fù)性速率VIBY