角質(zhì)細胞和黑素細胞混合培養(yǎng)的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)方法，尤其涉及一種角質(zhì)細胞與黑素細胞(黑色素細胞)混合培養(yǎng)的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膚色的不同主要取決于皮膚中黑素的數(shù)量、大小、類型及分布情況。黑素是一種蛋白衍生物，由表皮中的黑素細胞產(chǎn)生。
[0003]部分皮膚病患者身體各部位出現(xiàn)白斑是由于皮膚黑素細胞缺失、被破壞或無功能，進而影響皮膚色素制造系統(tǒng)引起。如白癜風便是一種常見的后天性限局性或泛發(fā)性皮膚色素脫失病，是由于皮膚的黑素細胞消失引起的，其他類似疾病還包括黑痣、黃褐斑、雀斑、太田痣等色素性疾病。這種疾病會對患者生理和心理上造成嚴重損害。目前的治療方法包括局部使用皮質(zhì)類固醇、NB-UVB/PUVA、準分子激光等，但療效低，并伴隨一定副作用。
[0004]其他的治療上述疾病的方法還包括:1)外科移植技術(shù)，如負壓吸皰法、刃厚皮片移植、微小皮片移植，但對大面積患者來說存在皮源緊缺問題；2)黑素細胞移植法，如CN102266586B公開的黑素細胞移植涂布載體、CN101892286B公開的黑素細胞培養(yǎng)方法，以及CN100354001C公開的黑色素細胞懸液制劑，均可用于黑素細胞移植，但該方法存在黑素瘤并發(fā)風險、均勻度較差的問題，且其最大技術(shù)難點在于黑素細胞生長較差，無法在短期內(nèi)大量擴增。
[0005]另一方面，分離黑素細胞除培養(yǎng)基外無其他特定方法，直接從活體內(nèi)分離的黑素細胞數(shù)量極少，且具有有限的均勻性和增殖能力，因此是毫無效率可言的。進一步，有報告稱，當在體外使用剛從表皮層中分離出的黑素細胞時，所述細胞對UVB等的刺激毫無反應(yīng)，又或與黑色素合成相關(guān)的基因的表達會有下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對目前黑素細胞體外培養(yǎng)所存在的問題，本發(fā)明提供了一種角質(zhì)細胞與黑素細胞共同培養(yǎng)的方法。
[0007]本發(fā)明第一個方面是提供一種用于角質(zhì)細胞和黑色素細胞的無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括:KGM-Gold培養(yǎng)基和KGM培養(yǎng)基。
[0008]其中，在第一個方面所述的培養(yǎng)基中，所述KGM-Gold培養(yǎng)基和KGM培養(yǎng)基相互獨立存在。
[0009]本發(fā)明第二個方面是提供一種角質(zhì)細胞與黑素細胞共同培養(yǎng)的方法，步驟包括:
[0010]保留表皮層和至少部分真皮層的皮膚樣本，破碎后，進行胰酶冷消化；
[0011]收集沉淀組織，用I型膠原酶進行熱消化，收集細胞；
[0012]原代接種，在KGM-Gold培養(yǎng)基中進行；
[0013]傳代培養(yǎng)，至細胞匯合，在KGM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0014]本發(fā)明第三個方面是提供一種制備人工表皮的方法，步驟包括:
[0015]保留表皮層和至少部分真皮層的皮膚樣本，破碎后，進行胰酶冷消化；
[0016]收集沉淀組織，用I型膠原酶進行熱消化，收集細胞；
[0017]原代接種，在KGM-Gold培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0018]傳代培養(yǎng)，至細胞匯合，在KGM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)至細胞分化分層；
[0019]收集形成的皮片。
[0020]在一種優(yōu)選實施例中，所述KGM-Gold培養(yǎng)基中添加有附加因子，所述附加因子可以是選自氫化可的松(hydrocortisone)、鐵源、腎上腺素(epinephrine)、牛腦垂體提取物(BPE)、表皮生長因子、胰島素、抗生素中的任意一種或幾種。
[0021]在一種優(yōu)選實施例中，所述KGM培養(yǎng)基中添加有附加因子，所述附加因子可以是選自KSR(Knockout血清替代物)、角質(zhì)細胞生長因子、氫化可的松、表皮生長因子、抗生素、鐵源中的任意一種或幾種。
[0022]其中，所述鐵源可以是能夠被細胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體接受并獲取鐵元素的物質(zhì)，如轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)、以及能夠起到相同作用的轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物中的任意一種或幾種。
[0023]其中，轉(zhuǎn)鐵蛋白可以是重組轉(zhuǎn)鐵蛋白、人源轉(zhuǎn)鐵蛋白、動物源轉(zhuǎn)鐵蛋白(如牛源轉(zhuǎn)鐵蛋白)中的任意一種或幾種。
[0024]其中，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物可以是檸檬酸鐵、二甲胂酸鐵、葡糖酸鐵中的任意一種或幾種。
[0025]其中，所述胰島素可以是重組胰島素、人源胰島素、動物源胰島素(如牛源胰島素)、以及類胰島素生長因子。
[0026]其中，所述抗生素可以是選自青霉素(Penicillin)、鏈霉素(streptomycin)、慶大霉素(Gentamicin)、GA-1000、兩性霉素 B (amphotericin B)、Pen/Strep (Penici 11 in-streptomycin)中的任意一種或幾種。
[0027]其中，所述角質(zhì)細胞生長因子如人角質(zhì)細胞生長因子(HKGS)、KGF-2、rhKGF_2、KGF-1、rhKGF-1中的任意一種或幾種。
[0028]其中，所述表皮生長因子如重組人表皮生長因子(rhEGF)、EGF中的任意一種或幾種。
[0029]在一種優(yōu)選實施例中所述角質(zhì)細胞與黑色素細胞可以是源于同一生物體或不同生物體，也可以是源于同一生物體的不同部位或相同部位。
[0030]所述皮膚樣本可以是異體和/或自體皮膚樣本，并優(yōu)選為自體皮膚樣本。所述皮膚樣本可以是源自胸部、腹部、背部、臀部、四肢等任意一種或幾種部位的皮膚。
[0031]在一種優(yōu)選實施例中，所述活性皮膚樣本中，真皮層占初始皮膚樣本中真皮層的體積比，優(yōu)選為15-50%，更優(yōu)選為20-45%，更優(yōu)選為25-40%，更優(yōu)選為30-35 %。
[0032]在一種優(yōu)選實施例中，表皮角質(zhì)細胞與黑色素細胞數(shù)量比例優(yōu)選為100: (0.001-80)，優(yōu)選為 100: (0.01-60)，優(yōu)選為 100: (0.1-50)，優(yōu)選為 100: (0.5-40)，優(yōu)選為 100: (1-30)，優(yōu)選為 100: (5-20)，優(yōu)選為 100: (10-15)。
[0033]在一種優(yōu)選實施例中，所述皮膚樣本中，真皮層厚度優(yōu)選為0.2_4mm，更優(yōu)選為
0.3-3.5mm,更優(yōu)選為0.5-3.0mm,更優(yōu)選為0.8-2.5mm,更優(yōu)選為1.0-2.2mm,更優(yōu)選為
1.2-2.0mm0
[0034]在一種優(yōu)選實施例中，所述傳代培養(yǎng)優(yōu)選為在原代培養(yǎng)第2-8天、優(yōu)選為3-6天、更優(yōu)選為4-5天進行。
[0035]在一種優(yōu)選實施例中，所述胰酶冷消化的時間優(yōu)選為8-24小時，更優(yōu)選為10-22小時，更優(yōu)選為11-20小時，更優(yōu)選為12-18小時，更優(yōu)選為14-16小時。
[0036]在一種優(yōu)選實施例中，所述胰酶冷消化過程中，胰酶質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.01-0.1 %，更優(yōu)選為0.02-0.08 %，更優(yōu)選為0.04-0.07 %，更優(yōu)選為0.05-0.06 %。
[0037]在一種優(yōu)選實施例中，所述I型胰酶熱消化的時間優(yōu)選為1-10小時，更優(yōu)選為
1.5-8小時，更優(yōu)選為2-6小時，更優(yōu)選為3-5小時。
[0038]在一種優(yōu)選實施例中，在KGM-Gold培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的過程中，培養(yǎng)基更換間隔優(yōu)選為至少12小時，更優(yōu)選為24小時，更優(yōu)選為36小時。
[0039]在一種優(yōu)選實施例中，在KGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-10天后收集皮片，更優(yōu)選為2_9天后、更優(yōu)選為3-8天后、更優(yōu)選為4-6天后收集皮片。
[0040]本發(fā)明的有益效果如下:
[0041](I)本發(fā)明方法適合所有人的正常皮膚組織，包括帶毛發(fā)部位。
[0042](2)本發(fā)明方法無需滋養(yǎng)層無需牛血清，可直接鋪在預(yù)處理過的培養(yǎng)皿或瓶中培養(yǎng)，近似于生理狀態(tài)的條件培養(yǎng)，消除了異種蛋白的影響。
[0043](3)本發(fā)明方法在分離提取時需要表皮并攜帶真皮，因為黑素細胞主要存在于表皮基底層，且能提取到更多增殖能力強的角質(zhì)細胞。
[0044](4)本發(fā)明方法使用的培養(yǎng)基只針對皮膚角質(zhì)細胞和黑素細胞的培養(yǎng)，避免了其它細胞的污染。
[0045](5)本發(fā)明方法提供了一種表皮細胞與黑色素細胞共培養(yǎng)的方法，并可獲得包含功能性黑素細胞且分布均勻的表皮膜片，可在白癜風等色素缺失的皮膚疾病上得到應(yīng)用。
[0046](6)本發(fā)明方法可以由很小面積的自體樣本獲得大面積的表皮膜片，解決了大面積皮膚患者皮片移植時皮源緊缺問題。
[0047]綜上所述，本發(fā)明提供的角質(zhì)細胞與黑素細胞共培養(yǎng)的方法，能夠培養(yǎng)成含黑素細胞的表皮用于移植。該方法是在體外進行擴增培養(yǎng)，