菊花耐鹽性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記及其獲得方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及菊花耐鹽性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記及其獲得方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.)原產(chǎn)中國，是菊科菊屬多年生宿根草 本植物。菊花品種繁多，種質(zhì)資源豐富，蘊(yùn)含著豐富的遺傳變異信息。土壤鹽害一直是影響 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要因素，設(shè)施栽培造成的次生性鹽害也越來越多的受到人們的關(guān)注。切 花菊種植于溫室大棚內(nèi)，栽培管理過程中施用化肥但不能得到雨水的充分淋溶，加之土壤 表層水分不斷地蒸發(fā)會(huì)造成設(shè)施土壤中鹽分積累，影響切花菊根系對(duì)水、肥的吸收，最終導(dǎo) 致其生長發(fā)育受阻，降低品質(zhì)。菊花耐鹽性為復(fù)雜的數(shù)量性狀，其遺傳機(jī)制復(fù)雜。因此，了 解切花菊品種資源的多樣性和親緣關(guān)系，挖掘與耐鹽性等數(shù)量性狀緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記有 利于開展相關(guān)性狀優(yōu)異等位基因位點(diǎn)挖掘和分子標(biāo)記輔助選擇育種。
[0003] 關(guān)聯(lián)分析（連鎖不平衡作圖或關(guān)聯(lián)作圖）以連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD)為基礎(chǔ)，以自然群體為研究對(duì)象，檢測(cè)群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或 候選基因的遺傳變異的顯著關(guān)聯(lián)；可同時(shí)檢測(cè)自然群體中的多個(gè)等位基因，利于在大量的 種質(zhì)資源中鑒定對(duì)目標(biāo)性狀有正向貢獻(xiàn)的優(yōu)異等位基因。相比傳統(tǒng)的QTL作圖技術(shù)，關(guān)聯(lián) 分析具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1)研究周期短，一般以自然群體為材料，無需構(gòu)建專門的作圖群體； (2)所用群體遺傳基礎(chǔ)廣，可同時(shí)對(duì)同一基因座的多個(gè)等位基因進(jìn)行分析；（3)定位精度 高，可達(dá)到單基因水平。利用自然群體在長期進(jìn)化過程中所累積的重組信息，分辨率高，可 實(shí)現(xiàn)QTL的精細(xì)定位，甚至可直接定位到基因本身；(4)可以通過多年、多點(diǎn)試驗(yàn)去除環(huán)境 因子對(duì)性狀統(tǒng)計(jì)的影響。
[0004] 土壤鹽堿化是全球性問題，嚴(yán)重影響了生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。目前我國菊花生產(chǎn) 基本上為分散型區(qū)域性生產(chǎn)，沿海和北方地區(qū)的鹽漬土壤嚴(yán)重限制了菊花的栽培推廣。因 此，提高菊花品種的耐鹽性是菊花育種研究中的一個(gè)重要目標(biāo)。然而目前關(guān)于菊花耐鹽性 關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的精確定位和克隆還尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中菊花耐鹽性優(yōu)質(zhì)基因的精確定位和克隆的研究在國內(nèi)外幾乎空 白這一現(xiàn)狀，本發(fā)明通過篩選出多個(gè)與菊花耐鹽性基因位點(diǎn)緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，從而建 立菊花耐鹽性分子標(biāo)記輔助選擇體系，提高菊花優(yōu)良耐鹽性種質(zhì)資源的選擇效率，為菊花 新品種選育奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)手段獲得：
[0006] 一種菊花耐鹽性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的獲得方法，包括以下步驟：
[0007]a、耐鹽性鑒定：選取不同來源且無直接親緣關(guān)系的若干個(gè)菊花品種，收集耐鹽性 數(shù)據(jù)，對(duì)耐鹽性數(shù)據(jù)進(jìn)行基本描述性統(tǒng)計(jì)分析；
[0008]b、菊花品種群體結(jié)構(gòu)分析：
[0009] 1)提取姻花品種的基因組DNA;
[0010] 2)隨機(jī)選取菊花品種基因組DNA，對(duì)SRAP、SCoT和EST-SSR引物組合進(jìn)行篩選，將 篩選出的擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的引物組合用于菊花品種的全基因組分子標(biāo)記 掃描，統(tǒng)計(jì)掃描得到的多態(tài)性條帶數(shù)據(jù)結(jié)果；
[0011] 3)對(duì)菊花品種群體進(jìn)行類群劃分，計(jì)算各個(gè)品種的Q值即某個(gè)品種的基因組變異 源于某個(gè)群體的概率，并繪制出群體結(jié)構(gòu)圖；
[0012] c、菊花品種親緣關(guān)系分析：根據(jù)三種標(biāo)記的整合數(shù)據(jù)分析品種間的親緣關(guān)系，得 到親緣關(guān)系系數(shù)K矩陣；
[0013]d、與菊花耐鹽性緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記的確定：應(yīng)用TASSEL5. 0軟件中的混合線 性模型MLM進(jìn)行耐鹽性與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，將步驟b群體分析中所得到的各個(gè)品種的Q 值和步驟c親緣關(guān)系分析中得到的K矩陣都作為協(xié)變量計(jì)入模型；以兩年隸屬函數(shù)值的平 均值作為耐鹽性鑒定的表型數(shù)據(jù)聯(lián)合以上分子數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，若P〈〇. 01，則認(rèn)為該標(biāo) 記位點(diǎn)是與菊花耐鹽性緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，同時(shí)得出該標(biāo)記位點(diǎn)的表型變異解釋率R2。
[0014] 所述的耐鹽性鑒定的具體方法優(yōu)選為：選取不同來源且無直接親緣關(guān)系的100個(gè) 以上的菊花品種，分別于連續(xù)兩年春季采集供試菊花品種的腳芽扦插于穴盤中，待其生根 并生長至10葉齡苗時(shí)對(duì)其進(jìn)行200mM/LNaCl鹽處理，處理后3d、5d和7d觀察不同品種幼 苗的受害情況，記錄受害葉數(shù)（黃葉、萎蔫葉、干枯葉），評(píng)定鹽害指數(shù)，鹽害指數(shù)分為5級(jí)，1 級(jí)：植株基本無受害癥狀，葉片綠色、健康；2級(jí)：植株基本正常，下部葉片稍有黃斑或黑斑； 3級(jí)：植株有些灰暗無生氣，下部有2-3片葉明顯發(fā)黑或萎蔫；4級(jí)：植株有些萎蔫，下部4-5 片葉變黑且干枯萎蔫；5級(jí)：植株明顯萎蔫，中下部葉均已變黑萎蔫或干枯。每個(gè)品種每個(gè) 時(shí)間點(diǎn)記錄5個(gè)植株的萎蔫指數(shù)，取其算數(shù)平均值；用隸屬函數(shù)法求出各品種的平均隸屬 函數(shù)值&作為最終各品種的耐鹽性鑒定數(shù)據(jù)，由于鹽害指數(shù)與耐鹽性成負(fù)相關(guān)，隸屬函數(shù) 值Xi計(jì)算公式為：Xi= 1- (x-xmin) + (x_-xmin);
[0015] 公式中的X為某個(gè)品種某個(gè)指標(biāo)的測(cè)定值，乂_和X_為所有品種該指標(biāo)的最小值 和最大值；每個(gè)品種的最終隸屬函數(shù)值為各個(gè)品種所有指標(biāo)的隸屬函數(shù)值的平均值，平均 隸屬函數(shù)值越大，其耐鹽性越強(qiáng)。
[0016] 所述的步驟3)優(yōu)選運(yùn)用STRUCTURE軟件中的Bayesian方法對(duì)菊花品種群體進(jìn) 行基于數(shù)學(xué)模型的類群劃分，得到每個(gè)供試品種相應(yīng)的Q值，即某個(gè)品種的基因組變異源 于某個(gè)群體的概率，并繪制出群體結(jié)構(gòu)圖；所述的步驟c:菊花品種親緣關(guān)系分析：應(yīng)用 SPAGeDi軟件，根據(jù)三種標(biāo)記的整合數(shù)據(jù)分析品種間的親緣關(guān)系，得到親緣關(guān)系系數(shù)K矩 陣。
[0017] 所述的步驟d優(yōu)選以兩年隸屬函數(shù)值的平均值作為耐鹽性鑒定的表型數(shù)據(jù)，應(yīng)用 TASSEL5. 0軟件中的混合線性模型MLM進(jìn)行耐鹽性與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，若P〈0. 01，則認(rèn) 為該標(biāo)記位點(diǎn)是與菊花耐鹽性緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，同時(shí)得出該標(biāo)記位點(diǎn)的表型變異解釋 率R2。
[0018] 本發(fā)明所述的菊花耐鹽性關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的獲得方法，進(jìn)一步優(yōu)選包括以下步驟：
[0019]a、耐鹽性鑒定：選取不同來源且無直接親緣關(guān)系的100個(gè)以上的菊花品種，分 別于連續(xù)兩年春季采集供試菊花品種的腳芽扦插于穴盤中，待其生根并生長至10葉齡苗 時(shí)對(duì)其進(jìn)行200mM/LNaCl鹽處理，處理后3d、5d和7d觀察不同品種幼苗的受害情況， 記錄受害葉數(shù)，評(píng)定鹽害指數(shù)，鹽害指數(shù)分為5級(jí)，1級(jí)：植株基本無受害癥狀，葉片綠色、 健康；2級(jí)：植株基本正常，下部葉片稍有黃斑或黑斑；3級(jí)：植株有些灰暗無生氣，下部 有2-3片葉明顯發(fā)黑或萎蔫；4級(jí)：植株有些萎蔫，下部4-5片葉變黑且干枯萎蔫；5級(jí)： 植株明顯萎蔫，中下部葉均已變黑萎蔫或干枯。每個(gè)品種每個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄5個(gè)植株的萎 蔫指數(shù)，取其算數(shù)平均值；用隸屬函數(shù)法求出各品種的平均隸屬函數(shù)值&作為最終各品 種的耐鹽性鑒定數(shù)據(jù)，由于鹽害指數(shù)與耐鹽性成負(fù)相關(guān)，隸屬函數(shù)值&計(jì)算公式為：X1 = l-(X-Xmin) + (Xmax-Xmin);
[0020] 公式中的X為某個(gè)品種某個(gè)指標(biāo)的測(cè)定值，乂_和X_為所有品種該指標(biāo)的最小值 和最大值；每個(gè)品種的最終隸屬函數(shù)值為各個(gè)品種所有指標(biāo)的隸屬函數(shù)值的平均值，平均 隸屬函數(shù)值越大，其耐鹽性越強(qiáng)；
[0021] b、菊花品種群體結(jié)構(gòu)分析：
[0022] 1)采用CTAB微量法提取菊花品種的基因組DNA;
[0023] 2)隨機(jī)選取8個(gè)菊花品種基因組DNA對(duì)SRAP、SCoT和EST-SSR引物組合進(jìn)行篩 選，將篩選出的擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的引物組合用于菊花品種的全基因組分 子標(biāo)記掃描，統(tǒng)計(jì)掃描得到的多態(tài)性條帶數(shù)據(jù)結(jié)果；
[0024] 3)運(yùn)用STRUCTURE軟件中的Bayesian方法對(duì)菊花品種群體進(jìn)行基于數(shù)學(xué)模型的 類群劃分，得到每個(gè)供試品