一種AaTSW2基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用與制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用與制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 青蒿（ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素是從其地上 部分分離出的一種含有過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是目前世界上公認(rèn)的最有效的治 療瘧疾藥物，特別是對(duì)腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，世界衛(wèi)生組織推薦的最有效 的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯(lián)合療法（ACTs)。目前青蒿素的主要來(lái)源是從青蒿植株的地 上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低（〇. 01 % -1 % )，使得這種藥物的大規(guī)模商業(yè) 化生產(chǎn)受到了限制。
[0003]AaTSW2是從青蒿中分離得到的一個(gè)WRKY類的轉(zhuǎn)錄因子。在青蒿植株中超表達(dá) AaTSW2可以顯著提高青蒿中青蒿素及二氫青蒿酸的含量，表明該基因在青蒿素生物合成途 徑中具有重要的調(diào)節(jié)作用。AaTSW2在葉片發(fā)育初期及不同組織部位中的表達(dá)譜與青蒿素合 成途徑中腺毛特異性表達(dá)的基因ADS、CYP71AV1和DBR2均具有較高的相似性。因此，該基 因的啟動(dòng)子也極有可能在腺毛中特異性表達(dá)。由于青蒿素是在青蒿的油性腺毛中合成，因 此，克隆得到青蒿腺毛特異性的啟動(dòng)子對(duì)青蒿素代謝工程具有較為重要的意義。在青蒿基 因工程研究中，目前所采用的啟動(dòng)子大多數(shù)是組成性的啟動(dòng)子，例如煙草花葉病毒35S啟 動(dòng)子（CaMV35)。這種啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在所有的組織和器官中表達(dá)，因此極可能會(huì) 對(duì)植物的正常生長(zhǎng)造成一定的負(fù)擔(dān)和危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種AaTSW2基因啟動(dòng)子，其能引導(dǎo)基因在 植物腺毛中特異表達(dá)，在利用植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種過(guò)程中， 本發(fā)明提供的啟動(dòng)子能夠特異性地在腺毛組織啟動(dòng)并高效表達(dá)外源基因，而且不會(huì)對(duì)植物 的生長(zhǎng)發(fā)育造成危害。
[0005] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明提供了一種啟動(dòng)子，為AaTSW2基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子的核苷酸序列如序列 表中序列1所示。
[0007] 進(jìn)一步地，該AaTSW2基因啟動(dòng)子的順式作用元件如附圖1所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了含有該AaTSW2基因啟動(dòng)子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、 重組菌或重組病毒。
[0009] 進(jìn)一步地，該表達(dá)盒由AaTSW2基因啟動(dòng)子、該啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的目的基因和終止 子組成。
[0010] 進(jìn)一步地，該重組載體為pCAMBIA1391Z-AaTSW2,融合了AaTSW2基因啟動(dòng)子 與gus報(bào)告基因，如序列表中序列1所示的DNA片段通過(guò)PstI和BamHl酶切位點(diǎn)插入 PCAMBIA1391Z載體。
[0011] 進(jìn)一步地，該重組菌為經(jīng)pCAMBIA1391Z-AaTSW2載體轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌。
[0012] 本發(fā)明還提供了該AaTSW2基因啟動(dòng)子在利用植物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物 的基因工程育種中的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選地，所述代謝產(chǎn)物為青蒿素。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種AaTSW2基因啟動(dòng)子的制備方法，包括以下步驟：
[0015] 步驟一、培養(yǎng)青蒿無(wú)菌苗；
[0016] 步驟二、使用PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子基因組序列PAaTSW2 ;
[0017] 步驟三、分析該啟動(dòng)子上的順式作用元件，確定AaTSW2基因啟動(dòng)子的類型；
[0018] 步驟四、將該AaTSW2基因啟動(dòng)子連入pCAMBIA1391Z載體；
[0019] 步驟五、將構(gòu)建好的載體pCAMBIA1391Z-AaTSW2載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；
[0020] 步驟六、將帶有pCAMBIA1391Z-AaTSW2載體的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化青蒿；
[0021] 步驟七、使用PCR技術(shù)檢測(cè)步驟六中獲得的轉(zhuǎn)基因植株；
[0022] 步驟八、確定啟動(dòng)子所引導(dǎo)的gus報(bào)告基因在植株中的表達(dá)部位。
[0023] 優(yōu)選地，步驟4中擴(kuò)增AaTSW2基因啟動(dòng)子的引物為：
[0024]上游引物-CCCTGCAGAGAATAACCCCTTACCTTTTTGT
[0025]下游引物-CCGGATCCGGAGAGAGAAAAAAGATGTAGAAACG〇
[0026] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供的AaTSW2基因啟動(dòng)子，可特異性地在腺毛組 織啟動(dòng)并高效表達(dá)外源基因，并且不會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成危害，能廣泛應(yīng)用于利用植 物腺毛組織表達(dá)和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因工程育種中。
[0027] 以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和 技術(shù)效果。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為AaTSW2基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件結(jié)構(gòu)圖；
[0029] 圖2為轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果圖；
[0030] 圖3為利用AaTSW2基因啟動(dòng)子與gus基因融合的載體pCAMBIA1391Z-AaTSW2轉(zhuǎn) 化青蒿后，所獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中的⑶S組織染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0032] 下述實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)見(jiàn)NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress的1989年版 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0033] 本實(shí)施例涉及的根癌農(nóng)桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細(xì)良，田云龍，郭萍，朱昌雄； 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的哈茨木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究，中國(guó)生物工程雜志，2008, 28 (3) :38-43》文 獻(xiàn)中公開(kāi)。根癌農(nóng)桿菌EHA105,質(zhì)粒pCAMBIA1391Z可通過(guò)公開(kāi)市售的商業(yè)渠道取得，如可 以從澳大利亞CAMBIA公司購(gòu)得，菌株編號(hào)為Gambarl。
[0034] 本實(shí)施例涉及AaTSW2基因啟動(dòng)子的獲得，具體包括如下步驟：
[0035] 步驟一、培養(yǎng)青蒿無(wú)菌苗
[0036] 青蒿種子用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡11^11，再用20%(?八）的似(：10浸泡 20min后，無(wú)菌水沖洗3次~4次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，接種于無(wú)激素的MS固體培 養(yǎng)基上，25°C、16h/8h(light/dark)光照培養(yǎng)，14天后即可獲得青蒿無(wú)菌苗。
[0037] 步驟二、PCR法克隆啟動(dòng)子基因組序列
[0038] 本實(shí)施例采用PCR法克隆AaTSW2基因啟動(dòng)子序列，具體步驟如下：
[0039] 1、基因組DNA提取
[0040] 用CTAB法提取青蒿基因組總DNA，取小片青蒿嫩葉于1. 5mL離心管中，加入600yL CTAB提取液，60Hz振蕩研磨100s;之后于70°C加熱40min，加入等體積的氯仿：異戊醇 (24:1)，輕柔顛倒混勾乳化lOmin;10000rpm/min離心lOmin;取上清于新的離心管中，加入 等體積異丙醇，顛倒混勾，12000rpm/min離心lOmin;棄上清，加入lmL75%乙醇清洗lOmin， 12000rpm/min離心lOmin;棄上清，吸干乙醇，當(dāng)乙醇完全揮發(fā)后，加入40yL水溶解。
[0041] 2、PCR擴(kuò)增
[0042] 以所提取的總DNA為模板，根據(jù)AaTSW2基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)基因特異性引物（表 1所示），通過(guò)PCR從總DNA中擴(kuò)增AaTSW2基因啟動(dòng)子，并測(cè)序。
[0043] 表1AaTSW2基因啟動(dòng)子引物
[0044]
[0045] 步驟三、分析啟動(dòng)子上的順式作用元件，確定AaORA基因啟動(dòng)子的類型
[0046] 本發(fā)明中得到的AaTSW2基因啟動(dòng)子的序列長(zhǎng)1303bp。為了尋找啟動(dòng)子上的順式 作用元件，用PlantCARE(http://bioinform