水稻黃嘌呤脫氫酶基因及其延緩葉片衰老基因工程應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明一個(gè)新的水稻黃嘌呤脫氫酶基因及其過(guò)度表達(dá)能延緩水稻衰老，屬 于基因工程領(lǐng)域，具體地講涉及水稻黃嘌呤與次黃嘌呤降解和延緩水稻衰老的基因。
[0002] 技術(shù)背景
[0003] 葉片衰老是植物發(fā)育過(guò)程中必然需要經(jīng)歷的生命現(xiàn)象，但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，葉片 過(guò)早衰老，常使植株整體光合作用水平下降，光合產(chǎn)物減少，造成作物產(chǎn)量低、品質(zhì)差。 近些年來(lái)育成的一些超級(jí)稻品種，其生育后期受逆境脅迫，如極端溫度，干旱，養(yǎng)分匱乏 等，功能葉片常發(fā)生早衰，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率低，空秕率高，嚴(yán)重影響了超級(jí)稻產(chǎn)量潛力的發(fā) 揮。據(jù)理論上推算，如果功能葉片推遲衰老1天，可使水稻增產(chǎn)2%左右。黃嘌呤脫氫酶 (Xanthinedehydrogenase, )(DH)是一種含鉬酶，在噪呤代謝過(guò)程中起重要作用，催化黃噪 呤（Xanthine)與次黃噪呤（Hypoxanthine)生成尿酸。逆境脅迫下，為增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng) 能力，植物通常加速體內(nèi)資源的循環(huán)利用，在這過(guò)程中，嘌呤代謝中XDH催化產(chǎn)生的中間產(chǎn) 物：酰脲類(lèi)物質(zhì)Ureides【包括尿囊素（allantoin)和尿囊酸（allantoate)】的循環(huán)再利用 起重要作用，因?yàn)閁reides具有較高的N/C比，作為N素在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，可減少碳水化合 物的能量消耗。在正常情況下，植物可以靠本身的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，R0S) 消除系統(tǒng)（酶系統(tǒng)和還原性物質(zhì)）清除體內(nèi)的自由基，但在植物進(jìn)入衰老時(shí)期，體內(nèi)活性氧 消除系統(tǒng)的活性下降使植物自由基的"產(chǎn)生一消除"平衡受到破壞，造成對(duì)細(xì)胞及組織的損 害，加速葉片衰老。由于XDH催化產(chǎn)生的中間產(chǎn)物Ureides是一種有效的活性氧清除劑，所 以通過(guò)增強(qiáng)植物體內(nèi)XDH活性，增加生理濃度的Ureides含量，能有效地減少自由基對(duì)蛋白 質(zhì)、膜脂質(zhì)以及DNA的損傷。
[0004] 本發(fā)明從〇s)(DH基因的克隆、過(guò)度表達(dá)能延緩水稻葉片在逆境脅迫下早衰，提出 利用基因進(jìn)行生育后期延緩衰老的水稻育種的改良方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明的目的在于公開(kāi)一個(gè)新的水稻黃嘌呤脫氫酶基因基因及其編碼的蛋白 質(zhì)，所編碼的蛋白質(zhì)具有催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸的功能。該基因的過(guò)度表達(dá)能延 緩水稻衰老，可用于超級(jí)稻育種。
[0006] 技術(shù)方案 一種水稻黃嘌呤脫氫酶基因你XZ與它來(lái)自水稻（OiyzaL.)，長(zhǎng)度為4485bp， 相應(yīng)編碼葉綠素合成酶的1369個(gè)氨基酸，全序列見(jiàn)SEQIDNO. 1。
[0007] 上述一種水稻黃噪呤脫氫酶基因編碼的蛋白質(zhì)，它來(lái)自水稻satiKaL.)， 命名為0s)(DH蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQIDNO. 2。用轉(zhuǎn)基因的方法或通過(guò)高代回交的方 法將該基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)移到超級(jí)稻骨干親本材料中，逆境脅迫下具有延緩衰老的功能，用于 水稻超級(jí)稻育種。
[0008] 有益效果 1、本發(fā)明公開(kāi)了 一種水稻黃嘌呤脫氫酶基因（(fee%基因)及其所編碼的蛋白質(zhì)。該基 因來(lái)自水稻L.)，其在水稻中過(guò)度表達(dá)，可延緩葉片衰老。
[0009] 2、本發(fā)明人提供的基因功能是參與植物黃嘌呤和次黃嘌呤分解生成尿酸 反應(yīng)，mRNA表達(dá)分析表明基因在水稻中組成性表達(dá)。
[0010] 3、本發(fā)明的基因來(lái)自水稻，其與高等植物蓖麻、擬南芥等具有較高的同源 性。與蓖麻XDH序列相似性為71. 39%，與擬南芥)(DH序列相似性為68. 59%，與動(dòng)物序列相 似性為45-50%，和微生物序列相似性約為30%。
[0011] 4、利用本發(fā)明基因作為目的基因構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體，其轉(zhuǎn)化可使 Kitaake和日本晴水稻品種逆境脅迫下延緩衰老，這一功能可用于轉(zhuǎn)基因稻育種。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1 水稻黃嘌呤脫氫酶基因的分子克隆 從DNA公共數(shù)據(jù)庫(kù)收集已鑒定的模式植物擬南芥的ZZ%基因序列，搜索GenBank(http://www.ncbi.nim.nih.gov.blast/)數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻僅3號(hào)染色體上 有一相似性較高的轉(zhuǎn)錄本，編號(hào)為0SJNBa0091B22. 11，在全長(zhǎng)編碼序列兩端設(shè)計(jì)引物，用水 稻總RNA反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA第一鏈作為通用序列模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。
[0013] 表1引物信息
基因的克隆使用的引物組合為CDS-F和CDS-R;構(gòu)建基因的過(guò)表達(dá)載體 所使用的引物組合為0E-F和0E-R，上下游引物5'端加接KpnI酶切位點(diǎn)，過(guò)表達(dá)載體PCR 鑒定使用的引物組合為1390-F和1390-R;構(gòu)建了 基因的RNAi干擾載體，干擾片段 1的擴(kuò)增所使用的引物為Ril-F和Ril-R，上下游引物5'端加接KpnI和SacI酶切位點(diǎn)， PCR鑒定使用的引物組合為1390-F和FAD2-R，干擾片段2的擴(kuò)增所使用的引物為Ri2-F 和Ri2-R，上下游引物5'端加接BamHI和MluI酶切位點(diǎn)，PCR鑒定使用的引物組合為 FAD2-F和1390-R;啟動(dòng)子區(qū)與報(bào)告基因6K5融合載體的構(gòu)建所使用的引物組合為CKS'-PF和aN-PR，上下游引物5'端加接KpnI和BgiII酶切位點(diǎn)；轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定使用 的引物組合為cDNA-F和cDNA-R;RT-PCR使用的引物組合為RT-F和RT-R，內(nèi)參引物組合為 Actin2-F和Actin2-R;real-timePCR使用的引物組合為XDH-real-F和XDH-real-R，內(nèi)參 引物組合為Ubq-real-F和Ubq-real-R; 實(shí)施例2 76Z7基因的序列信息與特性分析 通過(guò)搜索水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果表明你XZ%為單拷貝基因，由14外顯子，13個(gè)內(nèi)含 子組成，全長(zhǎng)cDNA為4485bp，編碼區(qū)為4110bp，包含一個(gè)長(zhǎng)為4110bp的開(kāi)放閱讀框，5'端 非編碼區(qū)130bp，3'端非編碼區(qū)245bp，編碼1368個(gè)氨基酸150KDa蛋白，N端具有43個(gè)氨 基酸的前導(dǎo)序列。根據(jù)DNAStar的分析結(jié)果，水稻)(DH等電點(diǎn)為6. 81，無(wú)強(qiáng)烈的親水/疏水 性。用蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位在線預(yù)測(cè)軟件，對(duì)蛋白XDH進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示)(DH為線粒體 蛋白，用TMHMM2. 0在線工具對(duì))(DH的氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，氨基酸序列跨 膜預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白未形成跨膜結(jié)構(gòu)域。
[0014] 采用DNAMAN軟件將水稻)(DH氨基酸序列與蓖麻、擬南芥、人類(lèi)、褐家鼠、家蠶、鮑氏 不動(dòng)桿菌的XDH氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列比對(duì)分析顯示不同物種)(DH 因有很強(qiáng)的保守性，水稻與高等植物蓖麻、擬南芥等具有較高的同源性。與蓖麻XDH序列相 似性為71. 39%，與擬南芥)(DH序列相似性為68. 59%，與動(dòng)物序列相似性為45-50%，和微生物 序列相似性約為30%。進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果表明水稻的)(DH與同為高等植物的蓖麻、擬南芥比 其他生物有更緊密的親緣關(guān)系，同時(shí)也說(shuō)明高等生物XDH之間的親緣關(guān)系比微生物)(DH密 切。
[0015] 實(shí)施例3 76Z7基因及相關(guān)基因的表達(dá)研究 利用半定量RT-PCR觀察水稻苗期根、莖、葉和不同生育時(shí)期葉片mRNA轉(zhuǎn)錄豐度 的變化以檢測(cè)基因表達(dá)模式。利用PCR擴(kuò)增調(diào)整內(nèi)參一致，本實(shí)驗(yàn)Ki/?身P 反應(yīng)循環(huán)數(shù)分別為28和26,在不同時(shí)期表達(dá)均為28。對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，在苗期根、莖、 葉中基因的表達(dá)量基本一致，表明)(DH為組成性表達(dá)；水稻葉片苗期和分蘗期 基因的表達(dá)量基本一致，但后期ftsXZ%基因的表達(dá)量明顯較高。
[0016] 應(yīng)用real-timePCR對(duì)不同品系水稻上下游基因及衰老相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行 了分析。野生型和XDH過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系湖的表達(dá)量較高且沒(méi)有顯著差異，在)(DH干擾轉(zhuǎn) 基因株系表達(dá)量較低；4^卩干擾株系表達(dá)量較高，野生型次之，)(DH過(guò)表達(dá)株系 表達(dá)量最低。
[0017] 用real-timePCR檢測(cè)了苗期水稻衰老相關(guān)的基因（必似、棚f/忽、r欣U、必奴、 尸從⑷、說(shuō)別、屈雙功的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型植株相比，）(DH干擾株系與水稻衰老相 關(guān)基因表達(dá)水平顯著上升，過(guò)表達(dá)植株中的表達(dá)水平下降，尤其是基因其表達(dá)量是 野生型和ZZ%過(guò)表達(dá)株系的1000多倍。
[0018] 實(shí)驗(yàn)例4 Os)(DH過(guò)表達(dá)延緩受脅迫水稻衰老 以粳稻品種日本晴為受體品種的OsiZ%過(guò)表達(dá)和干擾的T3代純合株系及野生型為材 料，在苗期進(jìn)行鹽、高溫、暗脅迫及干旱脅迫，并分別在脅迫前、脅迫及脅迫后恢復(fù)正常生長(zhǎng) 7天測(cè)定各種生理生化指標(biāo)，包括葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)、葉綠素含量、可溶性蛋白含量、保 護(hù)酶活性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA)含量、酰脲類(lèi)物質(zhì)含量、)(DH酶活性等，主要結(jié)果 如下： 1.鹽脅迫前、脅迫與脅迫后恢復(fù)正常生長(zhǎng)7天，過(guò)表達(dá)株系)(DH酶活性均高于野生型 和干擾株系，干擾株系最低。過(guò)表達(dá)株系光化學(xué)淬滅系數(shù)（Photochemicalquenching,qP) 變化不大，非光化學(xué)淬滅系數(shù)（Non-photochemicalquenching,NPQ)減小，干擾株系反之； 過(guò)表達(dá)株系葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量高于野生型和干擾株系。過(guò)表達(dá)株系、野生型和 干擾株系超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD)活性在脅迫期間升高，且三者差 異不顯著，而恢復(fù)生長(zhǎng)期間過(guò)表達(dá)株系降低的幅度要低于野生型和