一種利用重組鈍齒棒桿菌一步發(fā)酵法生產(chǎn)l-鳥氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到精氨酸酶基因的克隆表達(dá)獲得重組工程菌，同時(shí)將該工程菌應(yīng)用于 L-鳥氨酸的生產(chǎn)，屬于生物工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 鳥氨酸是一種堿性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有機(jī)溶劑。鳥氨酸接受 二分子NH4+和一分子C0 2形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被 水解成鳥氨酸和尿素。
[0003] L-鳥氨酸是一種重要的非蛋白質(zhì)氨基酸，是精氨酸和脯氨酸合成的重要前體物 質(zhì)。同時(shí)L-鳥氨酸是人體內(nèi)尿素循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，因此其對(duì)肝臟的解毒功能具有 重要的保障作用。L-鳥氨酸能夠刺激體內(nèi)生長激素的分泌，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成以及糖類和 脂質(zhì)的分解代謝作用。L-鳥氨酸和其他氨基酸一起制成的復(fù)方氨基酸有很好的保肝護(hù)肝以 及激發(fā)病態(tài)下肝臟的活力的作用。聯(lián)合使用L-鳥氨酸和苯乙酸能有效治療肝性腦病，特別 是對(duì)于鳥氨酸循環(huán)障礙的患者，L-鳥氨酸能通過促進(jìn)谷氨酰胺的合成和排泄來穩(wěn)定的降低 患者血氨濃度。鳥氨酸a-酮戊二酸鹽是很好的臨床營養(yǎng)劑，促進(jìn)外科創(chuàng)傷病人的恢復(fù)，改 善慢性營養(yǎng)不良，改善免疫功能。同時(shí)鳥氨酸和蘋果酸鹽和檸檬酸鹽合用能夠改善食品和 飲料的口味，減少苦味。在歐洲、美國以及日本，L-鳥氨酸都是作為膳食藥物來銷售的。
[0004] 工業(yè)上L-鳥氨酸的合成包括化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和L-精氨酸水解法。化 學(xué)合成作為早期L-鳥氨酸的生產(chǎn)方法，一般以丙烯醛、氰化氫、氨氣、C02為原料合成L-鳥 氨酸。但效果并不是很理想，主要表現(xiàn)在于合成的步驟繁瑣，產(chǎn)物得率低，而且得到的產(chǎn)物 是L-鳥氨酸和D-鳥氨酸的混合物，為后期的分離純化帶來很大的困難。同時(shí)化學(xué)法合成 L-鳥氨酸由于其環(huán)境的危害性，越來越不被現(xiàn)代工業(yè)所接受。生物合成法相對(duì)化學(xué)合成法 具有生產(chǎn)成本較低，環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)而受到重視。微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸主要是通過 誘變或者基因工程的方法獲得L-鳥氨酸高產(chǎn)菌株，以較為便宜的葡萄糖甚至是淀粉等最 為初始原料合成L-鳥氨酸。在這方面日本起步較早，上世紀(jì)五六十年代就開始鳥氨酸生產(chǎn) 的研究，主要以誘變篩選為主。1957年kinoshita等首先報(bào)道了利用谷氨酸棒狀桿菌的瓜 氨酸或精氨酸的突變株發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸。此后，okumuraheShibuya等人在這方面也做了大 量的工作總結(jié)出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸鹽抗性的谷氨酸棒桿菌以及具有精 氨酸和瓜氨酸，以及霉酚酸抗性等標(biāo)記的檸檬酸節(jié)桿菌突變株用于工業(yè)生產(chǎn)中。國內(nèi)陳寧、 劉樹慶等人在1999年開始研究鳥氨酸的生產(chǎn)，并以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，通過硫酸二 乙酯和紫外線誘變定向選育出一種鳥氨酸生產(chǎn)菌，并通過發(fā)酵優(yōu)化使得鳥氨酸產(chǎn)量達(dá)到 9. 85g/L。近幾年，隨著代謝工程技術(shù)的興起，通過代謝工程改造的方法，鳥氨酸的發(fā)酵生產(chǎn) 取得一定的進(jìn)展，其中，中山大學(xué)蔣玲艷等人以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，通過表達(dá)異源的 谷氨酸脫氫酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶，增加代謝流中NADPH的含量，使得L-鳥氨酸產(chǎn)量 得到提高，最終到14. 8g/L，而后蔣又通過代謝進(jìn)化和代謝工程的方法，最后得到鳥氨酸的 產(chǎn)量為24.lg/L。通過發(fā)酵法進(jìn)行鳥氨酸生產(chǎn)可以利用較簡(jiǎn)單的碳源，如葡萄糖等，成本非 常低廉，適合于工業(yè)的發(fā)展。
[0005] CorynebacteriumcrenatumSDNN403是實(shí)驗(yàn)室通過多級(jí)誘變篩選得到的一株 L-精氨酸高產(chǎn)菌株。在5-L發(fā)酵罐上，在96小時(shí)內(nèi)能夠利用葡萄糖獲得35/L左右的L-精 氨酸（專利號(hào)ZL03112896. 3,本菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心，保藏號(hào)CGMCCN0. 0890)。L-精氨酸可以在精氨酸酶的作用下水解形成L-鳥氨酸和 尿素。
[0006] 本發(fā)明通過表達(dá)載體pXMJ19,實(shí)現(xiàn)了將來源于Baciluscereus的精氨酸酶基因 argl成功在C.crenatumSDNN403中進(jìn)行表達(dá)，并利用此基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵，以葡萄糖為 底物，一步法生產(chǎn)L-鳥氨酸，實(shí)現(xiàn)了L-鳥氨酸的高效生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要研究內(nèi)容：本發(fā)明利用分子技術(shù)成功構(gòu)建了一株高效表達(dá)精氨酸酶 基因argl的工程菌株C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI。酶活測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組工程 菌具有較高的精氨酸酶活性?；讷@得的基因工程菌，在5-L發(fā)酵罐內(nèi)對(duì)該菌株利用葡萄 糖為底物采用雙階段pH調(diào)控的方法進(jìn)行L-鳥氨酸生產(chǎn)進(jìn)行了探究，并且對(duì)發(fā)酵條件，包括 誘導(dǎo)時(shí)間，MnS04添加量，雙階段pH調(diào)控的時(shí)機(jī)等進(jìn)行了優(yōu)化。在120g/L葡萄糖添加下， l〇8h內(nèi)獲得L-鳥氨酸的積累量為27. 9g/L。
[0008] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案：
[0009] 將來源于菌株Bacilluscereus的精氨酸酶基因argl連接在表達(dá)載體pXMJ19上， 并轉(zhuǎn)化至C.crenatumSDNN403得到重組菌株。以該工程菌為基礎(chǔ)，以葡萄糖為底物，通過 發(fā)酵法并采用雙階段pH調(diào)控的策略生產(chǎn)L-鳥氨酸。同時(shí)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。
[0010] 1?重組菌株C.crenatumSDNN403/pXMJ19_argI的構(gòu)建
[0011] (1)根據(jù)NCBI中Bacilluscereus全基因組核酸序列中argl基因序列，設(shè)計(jì)精氨 酸酶基因的PCR引物F和R。
[0012] F:5' -ACCCGAAGCTTATGAAAAAAGAAATCTCAGTTATTGG-3'(HindIII)
[0013] R:5' -ACCGGGATCCTTATTTTAGTTTTTCACCGAATAAAG-3'(BamHI)
[0014] 以Bacilluscereus基因組DNA為模板，以設(shè)計(jì)的F、R為精氨酸酶的上下游引物 擴(kuò)增得到精氨酸基因片段argl。將獲得的擴(kuò)增片段通過膠回收試劑盒回收后以一定的比 例回收產(chǎn)物按一定比例與PMD18-Tvector過夜連解，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-argI。將獲得 的重組載體pMD18-T-argI送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確后將該重組質(zhì) 粒和表達(dá)載體PXMJ19分別經(jīng)過HindIII和BamHI酶切后，回收相應(yīng)的片段（argl片段和 酶切后的PXMJ19片段），然后將回收的片段在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，獲得重組載 體pXMJ9-argI。將獲得的該重組載體pXMJ19-argI通過電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到C.crenatum SDNN403 中獲得重組菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI。
[0015] 2.重組菌株酶活力測(cè)定
[0016] 酶活測(cè)定方法：配制0. 2M底物L(fēng)-精氨酸（0. 2M碳酸鹽緩沖液，pH9. 0)，取0. 9ml 底物溶液，加入〇.lml酶液，40°C反應(yīng)lOmin。將酶反應(yīng)液稀釋相應(yīng)的倍數(shù)，取lml稀釋后 的反應(yīng)液，用Chinard比色法測(cè)定反應(yīng)液中L-鳥氨酸的含量。酶活定義單位為lmin催化 lumolL-精氨酸轉(zhuǎn)化成L-鳥氨酸所需的酶量。
[0017] Chinard比色法：1ml標(biāo)準(zhǔn)液中依次加入1ml的冰醋酸，1ml混合酸（諱三酮溶液）， 于沸水浴中反應(yīng)lh，測(cè)定515nm下的吸光度值。
[0018] 3.重組菌以葡萄糖為底物一步發(fā)酵法產(chǎn)L-鳥氨酸的發(fā)酵條件優(yōu)化
[0019]將獲得的重組菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI轉(zhuǎn)接到LBG培養(yǎng)基（LB+0. 5% 葡萄糖）活化培養(yǎng)兩次后，以10%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接到250mL搖瓶中裝有25mL的發(fā)酵培養(yǎng)基 中，30°C，220rpm，往復(fù)式搖床中進(jìn)行培養(yǎng)96h。
[0020] (1)誘導(dǎo)時(shí)間：分別在發(fā)酵的不同時(shí)期加入終濃度0. 7mM的IPTG，對(duì)重組菌的精氨 酸酶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。測(cè)定不同誘導(dǎo)時(shí)間下L-精氨酸和L-鳥氨酸的產(chǎn)量
[0021] (2)MnS〇j^添加量：Mn2+對(duì)精氨酸酶具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，在發(fā)酵液中添加不同 濃度的Mn2+對(duì)發(fā)酵產(chǎn)L-鳥氨酸具有較大的影響。設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基中不同濃度的MnSO4添 加量。發(fā)酵96h后測(cè)定不同此304添加量下L-精氨酸和L-鳥氨酸的產(chǎn)量。
[0022] 4.重組菌雙階段pH調(diào)控發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥氨酸
[0023]將獲得的重組菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19-argI轉(zhuǎn)接到LBG培養(yǎng)基（LB+0. 5% 葡萄糖）活化培養(yǎng)16h后以4 %的接種量轉(zhuǎn)接到250mL種子培養(yǎng)基中，在30°C，180r/min搖 床中培養(yǎng)2411至00562為35.0左右。將種子以10%的接種量轉(zhuǎn)接到5-1發(fā)酵罐中，在2.51 發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)96h。在前96h的發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH通過氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)，并且維持在 7. 0左右。96h后將發(fā)酵液的pH調(diào)整到9. 0左右，進(jìn)行第二階段的發(fā)酵產(chǎn)L-鳥氨酸，并且 維持12h。通過高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中L-精氨酸、L-鳥氨酸以及其他相關(guān)氨基酸的 含量。
[0024] (1)種子培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖，60;酵母粉，10;(NH4)2S04,2 ;KH2P04,2. 7 ;K2HP04， 0? 5 ;MgS04 ? 7H20,0. 2。
[0025] (2)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖，120;酵母粉，8 ;KH2P04,27 ;K2HP04,0. 5; MnS04 ?H20,0. 5 ;MgS04 ? 7H20,0. 2 ;
[0026] (3)氨基酸分析色譜條件
[0027] (a)色譜柱：安捷倫色譜柱TC_C18250*4. 6*5
[0028] (b)柱溫：4(TC
[0029] (C)流動(dòng)相：A相：稱取8.0克結(jié)晶乙酸鈉于1000毫升燒杯中，加入1000毫升 水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶水溶解，再加入225微升三乙胺，攪拌并滴加5 %的醋酸，將PH調(diào)到 7. 20±0. 05 ;加入5毫升四氫咲喃，混合后備用。B相：稱取12. 0克結(jié)晶乙酸鈉于800毫升 燒杯中；加入400毫升水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶溶解；滴加5%醋酸將PH調(diào)到7. 20±0. 05 ;將此 溶液加入800毫升乙腈和800毫升甲醇，混合后備用。
[0030] (d)檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器338nm
[0031] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0032] (1)本發(fā)明以高產(chǎn)精氨酸菌株C.crenatumSDNN403為出發(fā)菌株，構(gòu)建具有高效精 氨酸酶活性的重組鈍齒棒桿菌SDNN403,無需以價(jià)格昂貴的L-精氨酸為原料，能夠直接利 用廉價(jià)的葡萄糖為原料進(jìn)行L-鳥氨酸的生產(chǎn)。從而有效的降低了L-鳥氨酸的生產(chǎn)成本。
[0033] (2)本發(fā)明基于精氨酸酶的最適反應(yīng)pH和C.crenatumSDNN403發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸 所需的pH不同而采取了雙階段pH調(diào)控的策略，第一階段將發(fā)酵液的pH維持在7. 0左右， 使得重組菌能夠以葡萄糖為底物產(chǎn)生L-精氨酸；第二價(jià)段將發(fā)酵液pH調(diào)節(jié)至9. 0左右，使 得精氨酸發(fā)揮其最佳轉(zhuǎn)化L-精氨酸酶的性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明采用雙階段pH調(diào)控的策略，使得 發(fā)酵產(chǎn)生測(cè)L-精氨酸基本上能夠轉(zhuǎn)化成L-鳥氨酸。發(fā)酵液中積累到27. 9g/L的L-鳥氨 酸。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 實(shí)施例 1 :重組菌C.crenatumSDNN403/pXMJ19_argI的構(gòu)建
[0035] (1)根據(jù)NCBI中Bacilluscereus全基因組核酸序列中argl基因序列，設(shè)計(jì)精氨 酸酶基因的PCR引物F和R。
[0036] F:5' -ACCCGAAGCTTATGAAAAAAGAAATCTC