一種低聚果糖-新科斯糖的生產(chǎn)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種低聚果糖-新科斯糖的生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]蔗果低聚糖又稱寡果糖或低聚果糖，廣泛存在于天然水果和蔬菜中，不僅口感良好，而且具有優(yōu)良的生理功能。它能促進(jìn)腸道雙歧桿菌增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，改善和調(diào)節(jié)腸道功能，防治便秘和腹瀉；另外，具有低能量或無能量、預(yù)防齲齒、降低血清膽固醇、降低血脂和血壓等功效。通常生產(chǎn)得到的低聚果糖包括有蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，都呈線性分子，即都是IF型，對于6G型的低聚果糖(如新科斯糖)研究甚少。目前工業(yè)上主要利用黑曲霉 Aspergillus niger，青霉 Penicillium citrinum，運(yùn)動單胞菌 Zymomonasmobilis，乳桿菌Lactobacillus reutri等來生產(chǎn)低聚果糖。日本的Hayashi曾經(jīng)用桔青霉(Penicillium citrinum)發(fā)酵產(chǎn)得 l_kestose，nystose，neokestose，產(chǎn)量分別為 22%，14 % 和 11 % ο H.Atiyeh 用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)發(fā)酵得 6-kestose，neokestose，1-kestose，產(chǎn)量分別為 61.5%,29.7%和 8.8%，產(chǎn)量都不高。
[0003]新科斯糖(neokestose)是一種鹿果三糖族低聚糖，由果糖基C-2與鹿糖分子中的葡萄糖基C-6位相連所得，它除具有普通低聚果糖所具有的多項(xiàng)生理功能外，又具有更為優(yōu)越的促雙歧桿菌增殖能力，因此被稱為高效益生元。目前國內(nèi)外對于新科斯糖的開發(fā)應(yīng)用都暫時(shí)為空白。
[0004]固定化細(xì)胞(cell immobilizat1n)培養(yǎng)是20世紀(jì)中期興起的一種新型生物技術(shù)，是指利用物理或化學(xué)手段將游離的細(xì)胞或酶與固態(tài)的不溶性載體相結(jié)合，使其保持活性并反復(fù)使用的一種技術(shù)。與傳統(tǒng)分批游離發(fā)酵相比，利用固定化微生物技術(shù)具有細(xì)胞負(fù)荷高、生物催化高效、細(xì)胞可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，并可獲得高的目標(biāo)產(chǎn)量和原料轉(zhuǎn)化率，易于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與產(chǎn)物分離，有利于實(shí)現(xiàn)工藝過程的自動化、連續(xù)化，降低成本，具體表現(xiàn)在:(I)生物反應(yīng)器中可以獲得極高的菌體濃度，因而發(fā)酵速率可以大大提高，反應(yīng)器設(shè)備的生產(chǎn)強(qiáng)度得以強(qiáng)化；(2)產(chǎn)物分離純化過程中菌體從發(fā)酵液中的分離十分容易；(3)固定化細(xì)胞可以重復(fù)或長期使用，這樣既能夠簡化游離細(xì)胞過程需要不斷培養(yǎng)菌體的操作，又減少了營養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)，提高了生產(chǎn)率。
[0005]在各種固定化技術(shù)中，天然高分子和合成高分子材料的吸附和包埋是研究最活躍的微生物細(xì)胞固定化方法，然而采用固定化細(xì)胞制備新科斯糖還未見有專利報(bào)道。本發(fā)明采用包埋法固定化法夫酵母細(xì)胞進(jìn)行新科斯糖連續(xù)高強(qiáng)度生產(chǎn)，工業(yè)應(yīng)用意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，利用法夫酵母固定化細(xì)胞多次重復(fù)使用，縮短生產(chǎn)周期、提高新科斯糖的產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本，使大規(guī)模生產(chǎn)新科斯糖成為了可會K。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)新科斯糖的方法，包括如下步驟:
[0008](I)法夫酵母SJKOl的培養(yǎng)，包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)；
[0009](2)固定化法夫酵母的制備；
[0010](3) 1L罐單罐連續(xù)反應(yīng)制備新科斯糖；
[0011](4)產(chǎn)物的分離純化。
[0012]本發(fā)明的具體工藝步驟及工藝條件如下:
[0013]步驟(I)，法夫酵母SJKOl菌體的制備:
[0014]從斜面上挑一環(huán)菌體于含25mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，18?28°C，180r/min搖床培養(yǎng)24?48h，制得一級種子液；再將一級種子培養(yǎng)液接種到含10mL種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，18?28°C，180r/min搖床培養(yǎng)24?48h，得二級種子液；以接種量10?15%將二級種子液接入發(fā)酵罐，pH6.0?6.5，培養(yǎng)溫度18?28°C，通風(fēng)量為0.6?1.0vvm,攪拌轉(zhuǎn)速為160?220r/min，發(fā)酵時(shí)間24?48h，發(fā)酵液以4°C、5000rpm離心1min獲得法夫酵母菌體。
[0015]其中:
[0016]種子培養(yǎng)基組成為:鹿糖10?50g，蛋白胨3?8g，酵母膏2?8g，麥芽汁2?6g，水 100mL, pH6.0 ?6.5 ;
[0017]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:蔗糖30?100g，蛋白胨3?8g，酵母膏2?8g，麥芽汁2?6g，水 100mL, pH6.0 ?6.5。
[0018]步驟(2)中，法夫酵母固定化:
[0019]將質(zhì)量百分比濃度為4%?8%的聚乙烯醇(PVA)和1%?4%的海藻酸鈉(SA)混合溶液高壓滅菌，冷卻后與等體積細(xì)胞濃度為150?300g/L的菌懸液混勻，取長度適當(dāng)?shù)?mmX6mm的乳膠管，在一端采用內(nèi)徑約為1.00?4.0Omm的滴頭，將乳膠管裝入婦動栗，調(diào)節(jié)婦動栗速度至50?100drop/min，在攪拌條件下，將混合液逐滴滴入含有濃度為2%?4% CaCl2無菌溶液的10L攪拌式發(fā)酵罐中，控制固定化載體直徑2.0-5.0mm范圍，固化2?8h后，無菌正壓排出剩余氯化I丐液體，制得直徑2.0-5.0mm的固定化細(xì)胞。
[0020]步驟(3)中，10L罐連續(xù)反應(yīng)制備新科斯糖:
[0021]向含有固定化細(xì)胞(約占4L體積)的10L攪拌式發(fā)酵罐接入濃度為100?300g/L的無菌蔗糖溶液4L，催化反應(yīng)溫度為18?22°C，通入無菌氧氣攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為100?200r/min促進(jìn)蔗糖轉(zhuǎn)化為新科斯糖。第一批次反應(yīng)24h，以后連續(xù)發(fā)酵9個(gè)批次，每次反應(yīng)時(shí)間為16h。每個(gè)批次反應(yīng)結(jié)束時(shí)，通過罐體內(nèi)置旋漿過濾器正壓無菌操作截留固定化細(xì)胞，補(bǔ)加新鮮蔗糖溶液，進(jìn)行下一次反應(yīng)。每一批次的新科斯糖的轉(zhuǎn)化率均大于56%，雜質(zhì)少，菌體蛋白濃度小于0.2%，利于后續(xù)的分離純化。
[0022]步驟(4)中，新科斯糖的分離純化包括以下步驟:
[0023]A、往發(fā)酵液中加入活性炭脫色，活性炭加入量為發(fā)酵液體積的0.2?I %，脫色溫度為70 °C ;
[0024]B、將脫色液稀釋到糖濃度為15-25%，采用截留分子量為300D的濾膜進(jìn)行納濾，操作壓力4-6psi，可以有效地除去發(fā)酵液中的單糖等雜質(zhì)；
[0025]C、將納濾濃縮液經(jīng)真空減壓濃縮，即可得到純度為90%以上的新科斯糖漿狀物，真空濃縮真空度為0.1Mpa，溫度為60°C ;
[0026]D、將上步驟的漿狀物進(jìn)行真空冷凍干燥，即得白色或微黃色粉末。
[0027]所述的(I)步驟中的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:發(fā)酵液接種量為10?15%，pH6.0?6.5，培養(yǎng)溫度18?28°C，通風(fēng)量為0.6?1.0vvm,攪拌轉(zhuǎn)速為160?220r/min，發(fā)酵時(shí)間24?48h0
[0028]本發(fā)明提供的利用法夫酵母固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)新科斯糖的方法，適用于以海藻酸鈉、海藻酸鈣、明膠、聚乙烯醇凝膠、瓊脂、聚氨酯、光硬化樹脂或聚丙烯酸凝膠等為固定化介質(zhì)，固定化法夫酵母細(xì)胞催化合成新科斯糖。本發(fā)明采用聚乙烯醇和海藻酸鈉混合載體包埋細(xì)胞，克服了這兩種單一載體的缺點(diǎn)，具有傳質(zhì)性能好，固定化可操作性好，包埋活菌活性高的特點(diǎn)。本發(fā)明固定化酵母具有反應(yīng)迅速、抗污染能力強(qiáng)、可連續(xù)使用、產(chǎn)物分離方便等優(yōu)點(diǎn)，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)，本發(fā)明為工業(yè)化生產(chǎn)新科斯糖提供了一種有效的方法。
[0029]本發(fā)明所取得的技術(shù)進(jìn)步在于:
[0030]第一，固定化細(xì)胞使用壽命長，以固定化細(xì)胞為催化劑，可以連續(xù)催化合成新科斯糖至少長達(dá)170h，至少是游離細(xì)胞(24h)的7倍，這不但降低了原料消耗，而且節(jié)約了能耗，大大降低了生產(chǎn)成本；
[0031]第二，產(chǎn)物純度較高，利用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成新科斯糖，一方面可以避免游離細(xì)胞在催化過程中因破碎、死亡所產(chǎn)生的蛋白和其他氨基酸雜質(zhì)；另一方面，可以避免細(xì)胞與反應(yīng)液直接混合，給后續(xù)產(chǎn)物分離純化帶來困難；
[0032]第三，本發(fā)明中重復(fù)發(fā)酵10批次均能保持較高的發(fā)酵強(qiáng)度，每一批次的新科斯糖的轉(zhuǎn)化率大于56%，且持續(xù)發(fā)酵10批次后沒有檢測到雜菌，完全適應(yīng)工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵要求。
【附圖說明】
[0033]圖1顯示出本發(fā)明的使用法夫酵母制取新科斯糖的新技術(shù)工藝。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0035]實(shí)施例1
[0036](I)菌體的制備:
[0037]從斜面上挑一環(huán)菌體于含25mL培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，18°C，180r/min搖床培養(yǎng)48h，制得一級種子液；再將一級種子培養(yǎng)液接種到含10mL上述培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，18°C，180r/min搖床培養(yǎng)48h得二級種子液；以接種量10%將二級種子液接種發(fā)酵罐，pH6.0，培養(yǎng)溫度18°C，通風(fēng)量為0.6vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為160r/min，發(fā)酵時(shí)間24h，發(fā)酵液以4°C、5000rpm離心1min獲得法夫酵母菌體。
[0038]種子培養(yǎng)基組成為:鹿糖10g，蛋白胨3g，酵母膏2g，麥芽汁2g，水1000mL，pH6.0 ;
[0039]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:蔗糖30g，蛋白胨3g，酵母膏2g，麥芽汁2g，水1000mL，pH6.0。
[0040](2)細(xì)胞的固定化:
[0041]將質(zhì)量百分比濃度為4%的聚乙烯醇(PVA)和4%的海藻酸鈉(SA)混合溶液高壓滅菌，冷卻后與等體積細(xì)胞濃度為150g/L的菌懸液混勾，取長度適當(dāng)?shù)?mmX6mm的乳膠管，在一端采用內(nèi)徑約為1.0Omm的滴頭，將乳膠管裝入婦動栗，調(diào)劑婦動栗速度至50drop/min，在攪拌條件下，將混合液逐滴滴入含有濃度為4% CaCl2無菌溶液的1L攪拌式發(fā)酵罐中，控制固定化載體直徑2.0-3.0mm范圍，固化2h后，無菌正壓排出剩余氯化I丐液體，制得直徑2.0-3.0mm的固定化細(xì)胞。
[0042](3) 1L罐連續(xù)反應(yīng)生產(chǎn)新科斯糖:
[0043]向含有固定化細(xì)胞(約占4L體積)的1L攪拌式發(fā)酵罐接入濃度為100g/L的無菌蔗糖溶液4L，催化反應(yīng)溫度為18°C，通入無菌氧氣攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min促進(jìn)蔗糖轉(zhuǎn)化為新科斯糖。第一批次反應(yīng)24h，以后連續(xù)發(fā)酵9個(gè)批次，每次反應(yīng)時(shí)間為16h。每個(gè)批次反應(yīng)結(jié)束時(shí)，通過罐體內(nèi)置旋漿過濾器正壓無菌操作截留固