一種監(jiān)測畢赤酵母發(fā)酵終點的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及畢赤酵母表達外源蛋白領域，特別涉及在使用畢赤酵母誘導表達外源蛋白工藝中監(jiān)測發(fā)酵終點的方法。
【背景技術】
[0002]畢赤酵母是多種蛋白的理想表達體系(Cereghino G P, Cereghino J L, IlgenC，Cregg J M.Product1n of recombinant proteins in fermenter cultures of theyeast Pichia pastoris.Curr Opin B1technol.2002，13 (4):329 - 332)，其在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)時，一般分為三個階段(Invitrogen life technologies公司，Pichiafermentat1n process guidelines):首先利用基礎鹽溶液、PTMl微量元素作為初始培養(yǎng)基進行分批發(fā)酵培養(yǎng)；然后待分批發(fā)酵培養(yǎng)至甘油完全耗盡時，進行甘油分批補料培養(yǎng)；最后待甘油分批補料培養(yǎng)結束后，進行甲醇分批補料培養(yǎng)，即蛋白生產階段。其中，在蛋白生產階段的后期，菌體死亡時釋放出的蛋白水解酶會降解蛋白，導致發(fā)酵產量降低，因此，選擇合適的方法判斷發(fā)酵終點及時結束發(fā)酵對獲得高蛋白產量至關重要。
[0003]目前，判斷發(fā)酵終點一般采用高效液相色譜法或經驗法。高效液相色譜法能夠準確地檢測發(fā)酵液中目的蛋白的含量來判斷發(fā)酵終點(CN 104297378A)，然而，此方法需要專門的儀器，購買及運行成本較高，并且設備準備時間和檢測時間較長，待檢測出結果后，往往錯過了最合適的放罐時間，導致部分產品被降解，延長生產周期，這樣不僅無法獲得高產量，還增加了雜質含量以及后續(xù)的純化工藝成本。經驗法是生產中常用的發(fā)酵終點判斷方法，在特定工藝條件、多批生產的基礎上，發(fā)酵培養(yǎng)至一定時間后即結束發(fā)酵(CN101348820B)，而對于畢赤酵母發(fā)酵，通常當菌濃增加緩慢時結束發(fā)酵(劉海峰。重組胰島素前體轉化成人胰島素和地特胰島素的工藝研究。華東理工大學博士學位論文。2013)，但這種經驗法無法準確判斷發(fā)酵終點，常常導致提前或者延后結束發(fā)酵，給生產造成損失。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種監(jiān)測畢赤酵母發(fā)酵終點的方法，解決現有技術無法快速、準確判斷畢赤酵母發(fā)酵終點以及降低純化成本的問題。
[0005]本發(fā)明是通過測定發(fā)酵液的菌濃和電導率指標聯合判斷畢赤酵母的發(fā)酵終點，具體步驟為:
[0006](I)發(fā)酵液的定時取樣:誘導表達開始后定期連續(xù)取發(fā)酵液樣品；一般在發(fā)酵過程中當誘導表達開始后每12小時取發(fā)酵液樣品一次，待誘導表達36_48h后增大取樣頻率，每l_6h取樣一次。
[0007](2)發(fā)酵液樣品的處理:根據所測定指標的不同對樣品進行離心或稀釋處理；
[0008](3)測定指標:處理完的樣品測定菌濃以及電導率，并繪制菌濃和電導率隨誘導時間的變化曲線圖；
[0009](4)發(fā)酵終點的判斷:監(jiān)測發(fā)酵液菌濃和電導率隨發(fā)酵時間的變化，當菌濃指標達到最高點、電導率降低至28?35mS/cm時為發(fā)酵終點。
[0010]上述方法中測定的菌濃指標為菌體濕重、菌體干重、OD6。。中的一種，當測定菌體濕重時需要取發(fā)酵液樣品I?5ml置于預先稱重的離心管中于3000?12000rpm離心5?10分鐘并棄去上清進行樣品的前處理準備；當測定菌濃中菌體干重時樣品處理方法為:取發(fā)酵液樣品I?5ml置于預先稱重的離心管中于3000?12000rpm離心5?10分鐘，棄去上清，并置于80°C真空干燥至恒重；測定菌濃中OD6。。的樣品的處理方法為:將發(fā)酵液樣品用水稀釋100?1000倍，使最終讀數在0.2?0.8之間；
[0011]測定電導率時樣品的處理方法為:取發(fā)酵液樣品I?5ml于離心管中，3000?12000rpm離心5?10分鐘。
[0012]優(yōu)選的步驟(3)中電導率的測定中取離心后的樣品用純水稀釋5?10倍后檢測電導率。
[0013]監(jiān)測發(fā)酵液菌濃和電導率隨誘導時間的變化，當菌濃增加緩慢接近最高點或達到最高點后開始下降，同時電導率降低至28?35mS/cm，即為發(fā)酵終點。
[0014]優(yōu)選的，當菌濃增加緩慢接近最高點或達到最高點后開始下降，同時電導率降低至30?32mS/cm，即為發(fā)酵終點。
[0015]本申請中的畢赤酵母發(fā)酵為在發(fā)酵罐中利用畢赤酵母進行甲醇誘導表達外源蛋白的過程。畢赤酵母發(fā)酵過程中的蛋白生產階段，菌體一邊利用甲醇產生目的蛋白，一邊緩慢生長導致菌濃增加，而在畢赤酵母發(fā)酵中，培養(yǎng)基中的鹽除了維持菌體內外滲透壓平衡，還要滿足菌體生長、代謝的需要，所以鹽濃度隨著發(fā)酵的進行而降低，宏觀表現為電導率的降低。
[0016]另外由于在發(fā)酵后期，菌體繁殖速度減低，死亡的菌體逐漸增多，導致菌濃逐漸達到最高點的同時，菌體死亡釋放出的蛋白酶水解蛋白導致目的產物減少，當增加的蛋白量和減少的蛋白量達到平衡時，表現為產量達到最高，而在此階段，菌體的死亡除釋放出蛋白酶外，細胞內電解質，如鹽、有機酸等，也釋放進入發(fā)酵液，增加發(fā)酵液的導電性，部分抵消菌體生長代謝消耗鹽導致的導電性下降，表現為電導率下降變得緩慢。當出現電導率下降緩慢現象時，意味著表達量接近高點，經過實驗證明，當菌濃增加緩慢接近最高點或達到最高點后開始下降并且電導率降低至28?35mS/cm，優(yōu)選為30?32mS/cm，即為發(fā)酵終點。
[0017]本發(fā)明的有益效果為:
[0018](I)該方法中采用測定菌濃和電導率的方法判斷反應終點，相比現有的HPLC方法，樣品的前處理簡單，易于操作，檢測時間短，便于及時結束發(fā)酵，減少了發(fā)酵能耗和時間，提高工作效率，降低生產成本。
[0019](2)該方法采用菌濃和電導率的雙重指標來判斷發(fā)酵終點，相比經驗法，更能準確地判斷反應終點，避免提前或延后結束發(fā)酵，提高了生產效率。
【附圖說明】
[0020]圖1為實施例1中畢赤酵母重組菌在BSM培養(yǎng)基中表達外源蛋白時電導率、菌體濕重以及發(fā)酵液上清目的蛋白含量隨誘導時間變化的曲線圖。-?-為電導率變化曲線，-■-為菌體濕重變化曲線，-▲-為蛋白含量變化曲線。
[0021]圖2為實施例2中畢赤酵母重組菌在BSM培養(yǎng)基中表達外源蛋白時電導率、菌體干重以及發(fā)酵液上清目的蛋白含量隨誘導時間變化的曲線圖。-?-為電導率變化曲線，-■-為菌體干重變化曲線，-▲-為蛋白含量變化曲線。
[0022]圖3為實施例3中畢赤酵母重組菌在BSM培養(yǎng)基中表達外源蛋白時電導率、0D_以及發(fā)酵液上清目的蛋白含量隨誘導時間變化的曲線圖。-?-為電導率變化曲線，-■-為OD6。。變化曲線，-▲-為蛋白含量變化曲線。
【具體實施方式】
[0023]以下通過具體實施例進一步闡釋本發(fā)明，實施例僅用于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明所要求保護的范圍。
[0024]實施例1:
[0025]按照 Invitrogen life technologies 公司((Pichia fermentat1n processguidelines》中提供的培養(yǎng)基和方法進行畢赤酵母表達外源蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)，誘導溫度28°C，誘導pH5.0。在表達的過程中按照下列步驟進行:
[0026](I)發(fā)酵液的定時取樣:誘導表達開始后，每12h無菌取發(fā)酵液樣品一次；誘導48h后每3h取發(fā)酵液樣品一次；
[0027](2)發(fā)酵液樣品的處理:取2個5ml離心管，分別用電子天平稱重并記錄；分別取發(fā)酵液樣品4ml置于離心管中，3000rpm離心1min ;取上清液1ml，純水稀釋至5ml，待測電導率，其余上清液保存于4°C冰箱待用高效液相色譜法檢測目的蛋白含量，去除上清液的離心管待測菌體濕重。
[0028](3)測定菌體濕重及電導率:去除上清液的離心管稱重，計算出菌體濕重；稀釋好的發(fā)酵液上清測定電導率；做出菌體濕重、電導率隨誘導時間的變化曲線(圖1)。
[0029](4)發(fā)酵終點的判斷:監(jiān)測發(fā)酵液菌濃和電導率隨發(fā)酵時間的變化。誘導表達48h，按上述方法取樣并測定電導率、菌體濕重分別為32.63mS/cm及0.527g/ml ;誘導51h時，取樣并測得電導率及菌體濕重分別為31.0mS/cm及0.528g/ml，和48h相比，菌體濕重幾乎未增