一種用于分枝桿菌分型的基因芯片及其使用方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于分枝桿菌分型的基因芯片及其使用方法，屬于基因芯片檢測
技術領域。
【背景技術】：
[0002] 結核分枝桿菌感染引起的結核病是當今人類主要傳染病之一。自1985年以來，結 核病發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐漸上升，一份來自WHO的報告顯示1990年結核病發(fā)病率為每 十萬人中143例，1995年上升到每十萬人中152例，2000年每十萬人中達162例。據(jù)統(tǒng)計， 目前全世界大約已有三分之一的人口已感染結核分枝桿菌，每年有800萬人的結核病感染 患者，其中約有300萬人死亡，結核病已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。我國是世界第二大結 核病高危國家，結核病人數(shù)占亞太區(qū)病人數(shù)的70%，占全球的16%，2000年國內(nèi)感染結核 分枝桿菌的人數(shù)達到了 450萬，并且仍有不斷上升的趨勢。據(jù)2012年國家疾病控制中心發(fā) 布的法定傳染病疫情報告，僅2月份，我國肺結核發(fā)病總人數(shù)居所有法定傳染病種首位，達 124005例，其中死亡人數(shù)160例，僅次于乙型肝炎。我國結核病疫情具有感染人數(shù)多、患病 人數(shù)多、新發(fā)患者多、死亡人數(shù)多、農(nóng)村患者過和耐藥患者多等特點。
[0003] 隨著結核病的逐漸流行，非結核分枝桿菌（non-tuberculosis mycobacterium,NTM)發(fā)病的報道也日益增多，越來越受到關注。非結核分枝桿菌廣泛存在 于自然界中，目前已發(fā)現(xiàn)有40多種非結核分枝桿菌能引起人類各種疾病。非結核分枝桿菌 感染引起的臨床疾病有肺部病變、淋巴結炎、皮膚和軟組織感染以及播散性疾病等，其表現(xiàn) 與結核菌感染引起的癥狀及其相似，而大部分非結核分枝桿菌對抗結核藥物天然耐藥，常 規(guī)化療效果不佳。
[0004]對分枝桿菌的鑒定，八十年代主要采用傳統(tǒng)方法，這些方法操作簡單，但耗時較 長，尤其對于結核分枝桿菌、鳥分枝桿菌復合群等的緩慢生長的分枝桿菌通常鑒定要花費 4-8周時間，并且結果也容易受多種條件影響而導致不夠準確。1992年Telenti等采用限 制性長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP)，用于分枝桿菌鑒定，隨后16SrRNA、gyrB、16-23S基因測 序廣泛應用于分枝桿菌的鑒定。盡管這些分子生物學方法對于分枝桿菌的鑒定具有一定 的優(yōu)勢，但都存在一定的缺陷，如缺少統(tǒng)一操作標準及判斷標準、不能區(qū)分臨床常見分枝桿 菌、信息量小、靈敏度低、假陽性率高等不足。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]針對上述問題，本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種用于分枝桿菌分型的基因芯 片及其使用方法。
[0006]本發(fā)明的一種用于分枝桿菌分型的基因芯片及其使用方法，其使用步驟為：
[0007] 1、設計分枝桿菌分型特異性探針
[0008] 從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中下載已知靶基因序列，并進行比對，設計引物對其他菌株進 行靶序列擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后得到全部擬分型菌株HSP65基因序列，進行比對分析后， 設計探針2套（每套23種），陽性對照探針2個，陰性對照探針2個；
[0009] 2、芯片制備
[0010] 使用點樣儀將探針以設定的順序固定到醛基化修飾的玻片上，芯片是由分枝桿菌 分型探針、QC(點樣的陽性質(zhì)控）、BC(點樣的陰性質(zhì)控）、NC(雜交的陰性質(zhì)控）和PC(雜 交的陽性質(zhì)控）組成的陣列，所有的條碼序列探針用50%DMS0溶解，終濃度為10iiM，每 個點重復三次點制到玻片上，封閉芯片上未與寡核苷酸結合的醛基；
[0011] 3、核酸提取與擴增
[0012] 核酸提取以商業(yè)化試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司革蘭氏陽性細 菌基因組DNA小量提取試劑盒）進行，分別以不同菌種DNA為模板，進行PCR擴增；
[0013] 擴增體系為50uL，包括TaqDNA聚合酶0? 25yL，10X聚合酶緩沖液5yL，dNTP 4iiL，Mg2+為3iiL，模板1yL，上下游引物各1yL，加ddH20補足50iiL;
[0014]擴增參數(shù)為：95°(：預變性2111111;951€2〇8,551€2〇8,72°(：，2〇8，共35個循環(huán)；721€ 延伸5min ;
[0015] 4、芯片雜交
[0016] 在雜交體系中PCR產(chǎn)物與雜交液等體積混合，雜交液各成分終濃度為4XSSC， 0. 3%SDS，5%甲酰胺，雜交條件為45°C水浴雜交1小時，洗滌條件為常溫下洗液A(1XSSC， 0? 2 %SDS)，洗液B(0? 2XSSC)和洗液C(0? 1XSSC)中各洗滌 20s;
[0017] 5、芯片顯色與分析
[0018] 辣根過氧化物酶標記鏈酶親和素進行標記后，加入底物進行顯色，顯色后用微陣 列芯片掃描儀掃描分析，去除陰性對照背景，與芯片雜交說明對照，判定結果。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：它通過分析23種常見分枝桿菌hsp65基因序列，設計種屬 特異性探針，以待檢測樣品的基因組DNA為模板，用標記的引物組進行擴增，然后將得到的 擴增產(chǎn)物與生物芯片上的探針進行雜交，根據(jù)雜交結果確定分枝桿菌的種類，具有特異性 強、靈敏度高、結果穩(wěn)定可靠及適于批量樣本檢測的特點。
【附圖說明】：
[0020] 為了易于說明，本發(fā)明由下述的具體實施及附圖作以詳細描述。
[0021] 圖1為本發(fā)明中分枝桿菌分型檢測基因芯片的陣列示意圖，
[0022] 圖2為本發(fā)明中分枝桿菌分型檢測基因芯片上每個陣列上具體排列布局圖，
[0023] 圖3為本發(fā)明中典型的23種分枝桿菌分型芯片檢測圖，
[0024] 圖中：1_胞內(nèi)分枝桿菌；2-草分支桿菌；3-蟾分枝桿菌；4-恥垢分枝桿菌；5-次 要分枝桿菌；6_ 土分枝桿菌；7-戈登分枝桿菌；8-龜分支桿菌；9-結核分枝桿菌；10-金色 分枝桿菌；II-潰瘍分枝桿菌；12-瑪爾摩分枝桿菌；13-鳥分枝桿菌；14-膿腫分枝桿菌； 15-偶發(fā)分枝桿菌；16-瘰疬分枝桿菌；17-微黃分枝桿菌；18-下出分枝桿菌；19-胃分枝桿 菌；20-無色分枝桿菌；21-新金色分支桿菌；22-亞洲分枝桿菌；23-猿分支桿菌；NC-陽性 對照。
[0025]圖4為本發(fā)明中瑪爾摩分枝桿菌陽性質(zhì)粒的靈敏度檢測結果圖。
【具體實施方式】：
[0026] 為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明了，下面通過附圖中示出的具體 實施例來描述本發(fā)明。但是應該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范 圍。此外，在以下說明中，省略了對公知結構和技術的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的 概念。
[0027] 如圖1-2所示，本【具體實施方式】采用以下技術方案：其使用步驟為：
[0028]1、設計分枝桿菌分型特異性探針
[0029] 從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中下載已知靶基因序列，并進行比對，設計引物對其他菌株進 行靶序列擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后得到全部擬分型菌株HSP65基因序列，進行比對分析后， 設計探針2套（每套23種），陽性對照探針2個，陰性對照探針2個；
[0030] 2、芯片制備
[0031] 使用點樣儀將探針以設定的順序固定到醛基化修飾的玻片上，芯片是由分枝桿菌 分型探針、QC(點樣的陽性質(zhì)控）、BC(點樣的陰性質(zhì)控）、NC(雜交的陰性質(zhì)控）和PC(雜 交的陽性質(zhì)控）組成的陣列，所有的條碼序列探針用50%DMS0溶解，終濃度為10yM，每個 點重復三次點制到玻片上，封閉芯片上未與寡核苷酸結合的醛基；
[0032] 3、核酸提取與擴增
[0033] 核酸提取以商業(yè)化試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司革蘭氏陽性細 菌基因組DNA小量提取試劑盒）進行，分別以不同菌種DNA為模板，進行PCR擴增；
[0034] 擴增體系為50uL，包括TaqDNA聚合酶0. 25yL，10X聚合酶緩沖液5yL，dNTP 4iiL，Mg2+為3iiL，模板1yL，上下游引物各1yL，加ddH20補足50iiL;
[0035]擴增參數(shù)為：95°(：預變性2111111;951€2〇8,551€2〇8,72°(：，2〇8，共35個循環(huán)；721€ 延伸5min ;
[0036] 4、芯片雜交
[0037] 在雜交體系中PCR產(chǎn)物與雜交液等體積混合，雜交液各成分終濃度為4XSSC， 0. 3%SDS，5%甲酰胺，雜交條件為45°C水浴雜交1小時，洗滌條件為常溫下洗液A(1XSSC， 0? 2 %SDS)，洗液B(0? 2XSSC)和洗液C(0? 1XSSC)中各洗滌 20s;
[0038] 5、芯片顯色與分析
[0039] 辣根過氧化物酶標記鏈酶親和素進行標記后，加入底物進行顯色，顯色后用微陣 列芯片掃描儀掃描分析，去除陰性對照背景，與芯片雜交說明對照，判定結果。
[0040] 本【具體實施方式】為一種可檢測23種分枝桿菌的基因芯片，可以用于同時檢測和 鑒定胞內(nèi)分枝桿菌、草分支桿菌、蟾分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、次要分枝桿菌、土分枝桿菌、 戈登分枝桿菌、龜分支桿菌、結核分枝桿菌、金色分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿 菌、鳥分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、微黃分枝桿菌、下出分枝桿 菌、胃分枝桿菌、無色分枝桿菌、新金色分支桿菌、亞洲分枝桿菌和猿分支桿菌。其特征是包 含檢測分枝桿菌的4條通用引物，如表1所示；46條分枝桿菌特異性寡核苷酸探針，2條陰 性對照探針和2條陽性對照探針，如表2所示。上述探針分別分布在載體上。其是使用的 用于