通過極光激酶a的熒光原位雜交非侵入性檢測膀胱癌的制作方法
【專利說明】通過極光激酶A的熒光原位雜交非侵入性檢測膀胱癌
[0001] 本申請是申請日為2008年12月12日、申請?zhí)枮?00880123846. 7、發(fā)明名稱為"通 過極光激酶A的熒光原位雜交非侵入性檢測膀胱癌"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 本發(fā)明在由National Cancer Institute授予的授權(quán)號U01 CA 85078下由美國 政府支持進(jìn)行。美國政府具有本發(fā)明中的特定權(quán)利。
[0004] 本發(fā)明一般涉及癌癥檢測領(lǐng)域。更具體而言，它涉及膀胱癌的檢測。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及檢測患者中的膀胱癌的方法，其包括從患者的尿 中分離膀胱細(xì)胞；使膀胱細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交，其中探針識別極光激酶A(aurora kinaseA)基因的至少部分，以產(chǎn)生與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交的膀胱細(xì)胞樣品；并且計數(shù)樣 品中的膀胱細(xì)胞數(shù)目、樣品中的每個膀胱細(xì)胞中的極光激酶A基因拷貝數(shù)、和樣品中具有 極光激酶A基因的至少拷貝數(shù)第一閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目。
[0007] 附圖簡述
[0008] 下述附圖構(gòu)成本發(fā)明說明書的部分，并且包括在內(nèi)以進(jìn)一步證實本發(fā)明的特定方 面。本發(fā)明通過參考與本文呈現(xiàn)的特定實施方案的詳述組合的這些附圖中的一個或多個可 以得到更好地理解。
[0009] 圖1。極光激酶A在移行細(xì)胞癌（TCC)中的表達(dá)及其與DNA倍數(shù)性的關(guān)聯(lián)。A，通 過定量RT-PCR揭示的相鄰尿道上皮和TCC的成對樣品中的極光激酶A水平。B和C，分別 通過顯示近二倍體（2c)DNA含量和顯著的非整倍體（6c)的腫瘤核的圖像分析產(chǎn)生的DNA 直方圖。D，低級別（級別1-2)、淺表（Ta-Ha)和高級別（級別3)、侵入性（Tib和更高的） TCC以及近二倍體和非整倍體TCC中的極光激酶A的平均表達(dá)水平。
[0010] 圖2。在膀胱癌細(xì)胞系中的極光激酶A表達(dá)和染色體拷貝數(shù)。A，通過定量RT-PCR， 極光激酶A在膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)與經(jīng)培養(yǎng)的尿道上皮細(xì)胞（NU204)相比較。B，使用針 對染色體3、7和17的著絲粒探針通過定量FISH揭示的染色體拷貝數(shù)。C，在3組膀胱癌細(xì) 胞系中的極光激酶A的平均表達(dá)水平。D，在C中顯示的3組膀胱癌細(xì)胞系中，用針對染色 體3、7和17的著絲粒探針通過FISH揭示的癌細(xì)胞系中的平均染色體拷貝數(shù)。
[0011] 圖3。使用抗GFP抗體用包含野生型極光激酶A插入片段的腺病毒載體轉(zhuǎn)染的 SV40尿道上皮細(xì)胞中的極光激酶A-GFP融合蛋白的異位表達(dá)。A，顯示極光激酶A-GFP融合 蛋白的表達(dá)的Western印跡分析（上圖）。用DAPI作為核復(fù)染劑顯示極光激酶A-GFP融合 蛋白的異位表達(dá)的免疫熒光分析（下圖）。用不含極光激酶A插入片段的腺病毒載體感染 的細(xì)胞的免疫熒光圖像（a，b)。用紅色濾光器獲得的圖像揭示2個中心體（a)。用綠色濾 光器獲得的圖像揭示沒有極光激酶A-GFP融合蛋白的異位表達(dá)（b)。用包含極光激酶A插 入片段的腺病毒載體感染的細(xì)胞的免疫熒光圖像（c，d)。用紅色濾光器獲得的圖像顯示用 抗微管蛋白抗體揭示的中心體倍增（紅色）（c)。用綠色濾光器獲得的圖像顯示在中心體中 異位表達(dá)的極光激酶A-GFP蛋白質(zhì)（d)。B，通過異位表達(dá)的極光激酶A誘導(dǎo)的中心體和染 色體拷貝數(shù)的定量評估。C，與用PI復(fù)染劑揭示的DNA含量（紅色熒光）相關(guān)的異位表達(dá) 的極光激酶A-GFP蛋白質(zhì)（綠色熒光）的雙重?zé)晒釬ACS分析。在用包含野生型極光激酶A插入片段的腺病毒載體感染后的雙重?zé)晒夥植紙D（右圖）。用空腺病毒載體感染的細(xì)胞 的對照分布圖（右圖）。與對照相比較（左圖），注意到在指定為A和B的分布圖區(qū)域中的 非整倍體（aneuploid)細(xì)胞的增加（右圖）。D，通過C中顯示的雙重?zé)晒釬ACS分析和軟 瓊脂上的集落形成揭示的非整倍體細(xì)胞的定量評估。Ad/對照：用不含極光激酶A插入片 段的腺病毒載體感染的細(xì)胞，Ad/極光激酶AGFP:用包含野生型極光激酶A的腺病毒載體 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，M0I:感染復(fù)數(shù)。
[0012] 圖4。用極光激酶AFISH探針檢測排泄尿中的癌細(xì)胞。A，雙重?zé)晒釬ISH證實，極 光激酶A基因拷貝數(shù)（紅色）和染色體特異性探針的短臂（綠色）。正常尿道上皮細(xì)胞中 的極光激酶A的二倍體拷貝數(shù)（a)。在低級別（級別1-2)TCC中的低水平極光激酶A基因 擴(kuò)增（3個拷貝）（b)。在高級別（級別3)侵入性TCC中的高水平極光激酶A基因擴(kuò)增（>4 個拷貝）（c)。在包含極光激酶A的多個拷貝和染色體20p探針的高級別（級別3)侵入性 TCC中的染色體20的多體性polysomy(d)。B，來自具有膀胱TCC的23個患者（訓(xùn)練組） 的排泄尿樣品中的極光激酶A基因拷貝數(shù)的定量FISH分析。顯示了在個別患者中顯示極 光激酶A的低（3-4個拷貝）和高（>4個拷貝）擴(kuò)增水平的細(xì)胞百分比。C，由來自具有膀 胱癌的患者的23份尿樣品組成的訓(xùn)練組和來自7個健康未受影響對照的7份尿樣品中關(guān) 于極光激酶AFISH測試的R0C曲線（n= 30)。D，由來自具有膀胱癌的患者的51份尿樣品 組成的測試組和來自健康未受影響對照的30份尿樣品中關(guān)于極光激酶AFISH測試的R0C 曲線（n= 81)。E，通過組織學(xué)級別的極光激酶A得分。
[0013] 圖5。來自具有膀胱TCC的74個患者和37個健康對照（組合的訓(xùn)練和測試組） 的排泄尿樣品中的極光激酶A基因拷貝數(shù)的定量FISH分析。顯示了在個別患者中顯示極 光激酶A的低（3-4個拷貝）和高（>4個拷貝）擴(kuò)增水平的細(xì)胞百分比。
[0014]圖6。AURKA 20ql3探針的圖。
[0015] 舉例說明件實施方案的描沐
[0016] 以非整倍性形式表現(xiàn)染色體不穩(wěn)定性的惡性細(xì)胞經(jīng)常顯示額外的中心體和多極 有絲分裂紡錘體，暗示在細(xì)胞器控制有絲分裂時的染色體分離的異常在非整倍性的發(fā)展中 起作用。 13
[0017] 極光激酶A也稱為STK15或BTAK，是絲氨酸蘇氨酸激酶家族成員，其中包括果蠅 (〇1'08<^11；[11&)極光和釀酒酵母（3&0011&1'01115^68061'￥181&6)1?1^1激酶。 46這些激酶已鑒 定為人細(xì)胞中的正常染色體分離和中心體功能（包括中心體分離和突變調(diào)節(jié)）的關(guān)鍵調(diào)節(jié) 物。 7此外，已顯示位于染色體20ql3上的極光激酶A基因的過表達(dá)與非整倍性和染色體不 穩(wěn)定性相關(guān)，促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞和幾種人腫瘤（包括尿道上皮癌）中的致瘤性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展。 4,8
[0018] 有趣的是，經(jīng)誘導(dǎo)以經(jīng)歷體外轉(zhuǎn)化的原代人尿道上皮細(xì)胞表現(xiàn)染色體20ql3. 2的 擴(kuò)增，暗示在這個染色體上的一種或多種基因的過表達(dá)可能在膀胱癌的發(fā)展中起顯著作 用。 9這些觀察連同在染色體20ql3上的極光激酶A編碼基因也已鑒定為小鼠和人中的腫瘤 易感性基因座w以及極光激酶A誘導(dǎo)p53腫瘤抑制基因的功能滅活5的事實，暗示極光激 酶A的表達(dá)增加可能是人尿道上皮細(xì)胞中的染色體不穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵遺傳決定因素。
[0019] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及檢測患者中的膀胱癌的方法，其包括從患者的尿 中分離膀胱細(xì)胞；使膀胱細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交，其中探針識別極光激酶A基因的至 少部分，以產(chǎn)生與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交的膀胱細(xì)胞樣品；并且計數(shù)樣品中的膀胱細(xì)胞數(shù) 目、樣品中的每個膀胱細(xì)胞中的極光激酶A基因拷貝數(shù)、和樣品中具有極光激酶A基因的至 少拷貝數(shù)第一閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目。
[0020] 從患者的尿中分離膀胱細(xì)胞（最通常地，尿道上皮細(xì)胞）可以通過本領(lǐng)域已知的 任何技術(shù)來執(zhí)行。在一個實施方案中，分離膀胱細(xì)胞可以通過下述來完成：收集來自患者的 排泄尿樣品（約100_200ml)，在夠以使尿中的膀胱細(xì)胞形成團(tuán)塊的旋轉(zhuǎn)速度和持續(xù)時間下 離心，棄去上清液，并且使形成團(tuán)塊的膀胱細(xì)胞重懸浮于合適溶液中用于貯存或使用。在一 個實施方案中，離心的持續(xù)時間和旋轉(zhuǎn)速度是約15分鐘和以約lOOOrpm。在一個實施方案 中，使形成團(tuán)塊的膀胱細(xì)胞重懸浮于具有10%DMS0(二甲基亞砜）的2mlDMEM(Dulbecco/ VogtModifiedEagle'sMinimalEssentialMedium)中并且存于_70°C，直至在其在該 方法的后續(xù)步驟中使用前使重懸浮的膀胱細(xì)胞解凍的時候。
[0021] 在解凍后和在雜交前，膀胱細(xì)胞可以在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水）或適合于洗滌膀 胱細(xì)胞的其它緩沖液中洗滌一次或多次，例如3次，隨后為離心以使經(jīng)洗滌的膀胱細(xì)胞形 成團(tuán)塊。形成團(tuán)塊的經(jīng)洗滌的膀胱細(xì)胞可以在甲醇/乙醇（3:1)中固定，在2xSSC/0. 5% NP-40，pH7中在37°C下預(yù)處理30分鐘，隨后為在乙醇中在90°C下脫水5分鐘。如對于本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見，適合于制備用于與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交的膀胱細(xì)胞的其他 處理技術(shù)可以作為常規(guī)實驗內(nèi)容執(zhí)行。
[0022] 使膀胱細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù) 來執(zhí)行。經(jīng)標(biāo)記的DNA探針可以包括任何D