Fbxw7基因及表達(dá)產(chǎn)物在腎癌檢測(cè)、腎癌藥物制備中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及FBXW7基因及表達(dá)產(chǎn)物在腎癌檢 測(cè)、腎癌藥物制備中的用途，更具體的，本發(fā)明涉及一種FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制 備檢測(cè)腎癌的試劑或者試劑盒中的用途、一種檢測(cè)腎癌的試劑盒、一種FBXW7基因和/或 FBXW7蛋白在制備抑制腎癌細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的藥物中的用途、一種抑制 腎癌細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的裝置以及一種非治療目的的抑制腎癌細(xì)胞增殖 和/或誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] FBXW7 基因（F-box和WD-40 域蛋白 7)又稱HCDC4。
[0003] FBXW7作為泛素蛋白酶體降解途徑的重要識(shí)別因子之一，其作用的很多底物都是 癌基因，如重要的cyclinE，c-Myc，c-Jun和Notch都通過FBXW7介導(dǎo)的泛素蛋白酶體途徑 進(jìn)行降解的。研究顯示，F(xiàn)BXW7突變和缺失會(huì)導(dǎo)致與癌細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白累積，如Myc和 Cyclin-E。FBXW7可以通過降解在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過程中具有重要作用的蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì) 胞周期、增殖和分化。
[0004] Sahoko和一些人發(fā)現(xiàn)FBXW7是造血系統(tǒng)中一種重要的防御因子，它的缺失會(huì)導(dǎo)致 造血細(xì)胞難以成熟和急性淋巴性白血病的發(fā)生。Takehiko發(fā)現(xiàn)P5調(diào)節(jié)FBXW7的轉(zhuǎn)錄，這會(huì) 導(dǎo)FBXW7表達(dá)障礙和預(yù)后不良。Lwatukim表示在結(jié)直腸癌組織中FBXW7表達(dá)與正常組織相 比明顯降低是預(yù)后不良的標(biāo)志。宮頸癌中FBXW7突變導(dǎo)致其與cyclinE中的CDPS關(guān)聯(lián)減 弱，并誘導(dǎo)cyclinE不降解，這種調(diào)節(jié)缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期異常和腫瘤的發(fā)生。晚期膠質(zhì) 細(xì)胞瘤中FBXW7的缺失導(dǎo)致有絲分裂的異倍體增加。
[0005] 腫瘤的分級(jí)和分期對(duì)臨床上制定治療方案和估計(jì)預(yù)后有參考價(jià)值。病理分級(jí)是根 據(jù)組織分化程度即高、中、低以及未分化相對(duì)應(yīng)的IV、III、II和I級(jí)。而腫瘤的分期，?M分 期系統(tǒng)是目前國際上最為通用的腫瘤分期系統(tǒng)。每一種腫瘤的TNM分期系統(tǒng)各不相同，因 此TNM分期中字母和數(shù)字的含義在不同腫瘤所代表的意思不同。TNM分期中T，N，M確定后 就可以得出相應(yīng)的總的分期，即I期，II期，III期，IV期等。有時(shí)候也會(huì)與字母組合細(xì)分 為Ila或Illb等等。I期的腫瘤通常是相對(duì)早期的腫瘤有著相對(duì)較好的預(yù)后。分期越高意 味著腫瘤進(jìn)展程度越高。
[0006] ?M分期系統(tǒng)中：1，1'("1'"是腫瘤一詞英文"1\1111(^"的首字母）指腫瘤原發(fā)灶的情 況，隨著腫瘤體積的增加和鄰近組織受累范圍的增加，依次用T1~T4來表示；2，N( "N"是 淋巴結(jié)一詞英文"Node"的首字母）指區(qū)域淋巴結(jié)（regionallymphnode)受累情況。淋巴 結(jié)未受累時(shí)，用N0表示，隨著淋巴結(jié)受累程度和范圍的增加，依次用N1~N3表示；3,M("M" 是轉(zhuǎn)移一詞英文"metastasis"的首字母）指遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（通常是血道轉(zhuǎn)移），沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 者用M0表示，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者用Ml表示。在此基礎(chǔ)上，用IT#三個(gè)指標(biāo)的組合（grouping) 劃出特定的分期（stage)。
[0007]目前，未見關(guān)于FBXW7在腎癌進(jìn)展程度中生物學(xué)功能的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 依據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制備檢 測(cè)腎癌的試劑或者試劑盒中的用途。該用途是基于發(fā)明人的以下發(fā)現(xiàn)而作出的：FBXW7基 因在腎癌中為抑癌基因，F(xiàn)BXW7高表達(dá)的腎癌患者預(yù)后遠(yuǎn)優(yōu)于FBXW7低表達(dá)腎癌患者人群， FBXW7蛋白表達(dá)上調(diào)與RCC(腎細(xì)胞癌）臨床病理分級(jí)之間具有高度相關(guān)性（p= 0. 0094) 以及FBXW7表達(dá)上調(diào)與腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（TNM)階段也有很強(qiáng)的相關(guān)性（p= 0. 0080)。 FBXW7基因和/或FBXW7蛋白，包括其定性或定量信息能夠作為檢測(cè)腎癌發(fā)展的標(biāo)志物。
[0009] 依據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)腎癌的試劑盒，其包括檢測(cè)FBXW7 mRNA和/或FBXW7蛋白的試劑。
[0010] 該試劑盒包括的試劑能夠檢測(cè)定量FBXW7mRNA和/或FBXW7蛋白。根據(jù)本發(fā)明實(shí) 施例，所稱試劑包括定量FBXW7mRNA的qPCR引物SEQIDN0 :1和2，以及內(nèi)參基因引物SEQ IDN0 :3 和 4,，選擇的內(nèi)參基因?yàn)镚APDH基因，SEQIDN0 :1-4 分別為AAGGGCAACAACGACG， AGGGAGCAATGAAATGAAGT，CTGGGCTACACTGAGCACC和AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG;和 / 或所稱試 劑包括檢測(cè)FBXW7蛋白的免疫組織化學(xué)試劑。所稱的qPCR或者qRT-PCR，是通過實(shí)時(shí)（real time)的方法，測(cè)定樣品中某個(gè)模版的起始量ct值，即循環(huán)閾值。由于前面RNA提取、反 轉(zhuǎn)等步驟，各個(gè)步驟存在不同的效率，ct值并無法真實(shí)反應(yīng)樣品中模版的絕對(duì)量，因此，需 要一個(gè)內(nèi)參來做為參考。選擇的內(nèi)參基因應(yīng)是穩(wěn)定的，在不同樣品中被認(rèn)為是表達(dá)量一致 的，通過測(cè)量?jī)?nèi)參基因，可以在后面分析過程中將不同樣品的起始量均一化。選擇的內(nèi)參需 要實(shí)在不同樣品中有穩(wěn)定表達(dá)量的基因，在該實(shí)施例中，經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，選擇GAPDH基因作 為內(nèi)參，以及利用SEQIDN0:l-4,能夠很好的用于相對(duì)定量FBXW7mRNA。免疫組織化學(xué)， (Immunohistochemistry，IHC)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織 細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定 的一項(xiàng)技術(shù)，其是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行 定位、定性及定量的研究。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所稱試劑盒還包括標(biāo)簽或者說明書，所述標(biāo)簽或者說明書 注有以下內(nèi)容，以對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行說明：當(dāng)所檢腎癌患者的FBXW7蛋白為低表達(dá)，則提示其 術(shù)后的五年生存率低于0. 3的概率遠(yuǎn)高于FBXW7蛋白為高表達(dá)的腎癌患者人群，和/或提 示其處于TW分期的中后期的概率高于FBXW7蛋白為高表達(dá)的腎癌患者人群；所稱FBXW7 蛋白為高表達(dá)或者為低表達(dá)是通過對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分來判定的，所述免疫組織 化學(xué)結(jié)果的分值為axb，定義ax 4為低表達(dá)，axb>4為高表達(dá)，其中，a、b均為整 數(shù)，a為切片的染色強(qiáng)度的等級(jí)，a的取值范圍為0-3,0-3等級(jí)依次分別對(duì)應(yīng)的切片的染色 強(qiáng)度為陰性、弱陽性、中度陽性和強(qiáng)陽性，b為陽性細(xì)胞百分比得分，b的取值范圍為1-5， 1-5分?jǐn)?shù)依次對(duì)應(yīng)于陽性細(xì)胞百分比[1 %，5% ]、（5%，25% ]、（25, 50% ]、（50%，75% ] 和（75%，100%]。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該試劑盒進(jìn)一步包括，切片的蘇木精染色強(qiáng) 度陰性對(duì)照?qǐng)D和中度陽性對(duì)照?qǐng)D，用作a取值時(shí)的參考，有利于將FBXW7蛋白的量準(zhǔn)確定為 高表達(dá)或低表達(dá)。
[0012] 利用該試劑盒及其包含的檢測(cè)結(jié)果說明或?qū)φ?，來檢測(cè)腎癌患者，能夠用以預(yù)估 判斷或者輔助判斷該個(gè)體的腎癌的發(fā)展階段、術(shù)后腎癌發(fā)展情況等，能夠用以輔助臨床診 斷監(jiān)測(cè)、選擇適合的治療方式。
[0013] 依據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制備 抑制腎癌細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的藥物中的用途。該用途是基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn) FBXW7基因高表達(dá)會(huì)抑制腎癌的增殖以及誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡而作出的。FBXW7基因能夠用 于治療腎癌的潛在靶點(diǎn)，腎癌藥物作用的目標(biāo)基因。
[0014] 依據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種抑制腎癌細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞 凋亡的裝置，該裝置包括：基因表達(dá)調(diào)節(jié)單元，用以使所述腎癌細(xì)胞中的FBXW7基因表達(dá)上 調(diào)，以抑制所述腎癌細(xì)胞和/或誘導(dǎo)所述腎癌細(xì)胞凋亡。該裝置是基于發(fā)明人體外試驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)FBXW7基因高表達(dá)能夠抑制腎癌的增殖以及誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡而作出的，在腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn) 染FBXW7質(zhì)粒后，通過CCK8、集落形成和流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)，顯示腎癌細(xì)胞ACHN和A704 細(xì)胞系增殖活性降低，細(xì)胞凋亡增加；而通過Westernblot分析，F(xiàn)BXW7高表達(dá)的腎癌細(xì)胞 與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，其細(xì)胞增殖活化蛋白c-Myc和c-Jun的表達(dá)均下調(diào)。FBXW7基因表 達(dá)上調(diào)能夠抑制腎癌的增殖或者誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡，F(xiàn)BXW7基因能夠用于治療腎癌的潛在 靶點(diǎn)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用FBXW7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所述腎癌細(xì)胞，使腎癌細(xì)胞中的FBXW7 基因過表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)腎癌細(xì)胞中的FBXW7基因的表達(dá)上調(diào)。
[0016] 依據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供一種抑制腎癌細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞 凋亡的方法，所述方法用于非治療目的，該方