梯度濃 度。
[0022] 增加標(biāo)準(zhǔn)品可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增程度，更有利于增加檢測(cè)準(zhǔn)確性。通 過定量標(biāo)準(zhǔn)品獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對(duì)J1ER2基因和內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行精確定值。陰性質(zhì)控 品主要用于判斷檢測(cè)過程中是否存在污染情況。
[0023] 作為優(yōu)選方案，以上任一所述HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒中，還包括含Mg2+、DNA聚 合酶及dNTPs的PCR反應(yīng)緩沖液?？梢愿鶕?jù)需要自行配制或者直接購買市售商品，例如 TAKARA公司的PCR緩沖液。
[0024] 作為優(yōu)選方案，上述HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，試劑分為HER2/GAPDH定量標(biāo)準(zhǔn) 品、陰性質(zhì)控品、以及J1ER2反應(yīng)體系和GAPDH反應(yīng)體系共四個(gè)獨(dú)立包裝的體系，其中 HER2反應(yīng)體系：10XPCR反應(yīng)緩沖液2. 5yL，濃度10yM的HER2(R)-F0. 5yL，濃度 10yM的HER2 (R)-R0. 25yL，濃度10yM的HER2 (R)-FP0. 5yL，無菌超純水將反應(yīng)體系 補(bǔ)至 19.8yL; GAPDH反應(yīng)體系：10XPCR反應(yīng)緩沖液2. 5yL，濃度10yM的GAPDH-F0. 5yL，濃度 10yM的GAPDH-R0. 25yL，濃度10yM的GAPDH-FP0. 5yL，無菌超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至 19. 8yL〇
[0025] 本發(fā)明還提供以上任一所述的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒的使用方法，是將待檢 樣品抽提DNA后，分別使用HER2引物組和GAPDH內(nèi)參引物組進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，如果 檢測(cè)通道沒有出現(xiàn)S形擴(kuò)增曲線，判斷為HER2和GAPDH擴(kuò)增陰性；如果檢測(cè)通道出現(xiàn)S形 擴(kuò)增曲線，參照以下三種標(biāo)準(zhǔn)判斷： (1) 如果HER2基因和GAPDH內(nèi)參基因檢測(cè)濃度至少一項(xiàng)小于1X103拷貝/mL，則檢測(cè) 結(jié)果無效，應(yīng)重新提取樣本核酸進(jìn)行檢測(cè)； (2) 如果HER2基因和GAPDH內(nèi)參基因檢測(cè)濃度均在1X103拷貝/mL~lX10s拷貝/mL之間，直接進(jìn)行以下計(jì)算： M=HER2基因檢測(cè)濃度/GAPDH內(nèi)參基因檢測(cè)濃度， 當(dāng)M彡0. 2時(shí)，則結(jié)果判讀為：無HER2基因擴(kuò)增， 當(dāng)M>0. 2時(shí)，則結(jié)果判讀為：HER2基因擴(kuò)增； (3) 如果HER2基因和GAPDH內(nèi)參基因檢測(cè)濃度至少一項(xiàng)大于1X10s拷貝/mL，則需要 將待檢樣品稀釋至線性范圍后重新測(cè)定，并根據(jù)（2)的標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。
[0026] 作為優(yōu)選方案，上述HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒的使用方法中，熒光定量PCR擴(kuò)增 程序?yàn)椋?5~55°C20 分鐘；92~95°C3~5 分鐘；92~95°C10~15 秒；55~65°C，10~35 秒，40 個(gè) 循環(huán)。優(yōu)選為：50°C，20分鐘；94°C，4分鐘；94°C，15秒；60°C，35秒，40個(gè)循環(huán)。
[0027] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果： 利用本發(fā)明的檢測(cè)引物組和試劑盒可以快速、簡便地檢測(cè)乳腺癌患者中J1ER2基因是 否發(fā)生擴(kuò)增，相比目前乳腺癌HER2檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)FISH法，具有檢測(cè)靈敏度高、時(shí)間短、一般 1. 5到2小時(shí)即可得到反應(yīng)結(jié)果，并且成本低、假陽性少，適合于大規(guī)模臨床開展。從而實(shí)現(xiàn) 對(duì)HER2基因擴(kuò)增快速、有效且準(zhǔn)確的檢測(cè)，因而能保證及時(shí)的病例診治及治療效果監(jiān)測(cè)。
[0028] 本發(fā)明的檢測(cè)引物通過熒光定量PCR擴(kuò)增，由定量標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)HER2基因和 內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行精確定值，然后計(jì)算HER2基因和內(nèi)參基因GAPDH拷貝數(shù)比值，從而確 定是否存在J1ER2基因擴(kuò)增。HER2基因擴(kuò)增是決定乳腺癌患者是否采用赫賽汀和帕妥珠單 抗治療有效性關(guān)鍵性指標(biāo)。因此臨床標(biāo)本檢測(cè)中是否存在HER2基因擴(kuò)增，可為臨床醫(yī)生選 擇靶向藥物提供參考，降低治療風(fēng)險(xiǎn)以及負(fù)擔(dān)。
【附圖說明】
[0029] 圖1是實(shí)施例1中采用熒光定量PCR儀檢測(cè)8例乳腺癌患者石蠟標(biāo)本得到的擴(kuò)增 曲線。
[0030] 圖2是實(shí)施例2中采用熒光定量PCR儀檢測(cè)梯度濃度HER2/GAPDH定量標(biāo)準(zhǔn)品得 到的曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明 所采用的試劑均為市售。
[0032] 實(shí)施例1 1.引物與探針的設(shè)計(jì) 針對(duì)HER2轉(zhuǎn)錄組受體結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)特異性引物HER2 (R) -F和HER2 (R) -R，與Taqman熒 光探針HER2 (R) -FP。Taqman熒光探針HER2 (R) -FP的5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是6-羧基 焚光素（6_carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)，3'端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)是黑洞淬滅劑1(BlackHole Quencher1，BHQ1)。
[0033] 其中，HER2 (R)-F:AACACCCACCTCTGCTTCGT(SEQIDNO: 1)， HER2(R)-R：GCCCACACACTCGTCCTCT(SEQIDNO:2), HER2(R)-P：TGCCCTGGGACCAGCTCTTTCG(SEQIDN0:3)〇
[0034] 2?引物與探針的設(shè)計(jì) 針對(duì)GAPDH基因設(shè)計(jì)特異性引物GAPDH-F和GAPDH-R，與Taqman熒光探針GAPDH-FP。Taqman熒光探針GAPDH-FP的5 '端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是6-羧基熒光 素（6-〇31~13(?5^111〇代8〇6；[11，？4]\〇,3'端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)是黑洞淬滅劑10313〇1<：11〇16 Quencher1，BHQ1)。
[0035] 其中，GAPDH-F:TGCACCACCAACTGCTTAGC(SEQIDN0:4)， GAPDH-R：GGCATGGACTGTGGTCATGAG(SEQIDNO:5), GAPDH-FP：CCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTT(SEQIDN0:6)〇
[0036] 3.HER2反應(yīng)液的配制 將各成分（引物、探針和PCR反應(yīng)緩沖液）按一定比例混合在一起。單個(gè)反應(yīng)聚合酶鏈 式反應(yīng)液包括 10XPCR反應(yīng)緩沖液 2. 5yL，HER2 (R)-F(濃度 10yM) 0? 5yL，HER2 (R)-R (濃度 10yM) 0.25yL，HER2(R)-FP(濃度 10yM) 0.5yL，dNTP2.0yL，最后用無菌超純 水將反應(yīng)體系補(bǔ)至19. 8yL。
[0037] 4.GAPDH反應(yīng)液的配制 將各成分（引物、探針和反應(yīng)緩沖液）按一定比例混合在一起。單個(gè)反應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)液包括10XPCR反應(yīng)緩沖液2. 5yL，GAPDH-F(濃度10yM) 0? 5yL，GAPDH-R(濃度 10yM) 0.25yL，GAPDH-FP(濃度 10yM) 0.5yL，dNTP2.0yL，最后用無菌超純水將反應(yīng) 體系補(bǔ)至19. 8yL。
[0038] 5?檢測(cè)反應(yīng) 取HER2反應(yīng)液19. 8yL和DNA聚合酶0. 2yL( 1個(gè)單位)配制成反應(yīng)體系1，然后加入 5. 0yL待檢模板。取GAPDH反應(yīng)液19. 8yL和DNA聚合酶0. 2yL(1個(gè)單位)配制成反應(yīng) 體系2,然后加入5. 0yL待檢模板。每批次反應(yīng)均設(shè)置陰性質(zhì)控（H20)和HER2/GAPDH病毒 定量標(biāo)準(zhǔn)品I-IV。反應(yīng)條件：50°C，20分鐘；94°C，4分鐘；94°C，15秒；60 °C，35秒，40個(gè) 循環(huán)。
[0039] 采用ABI7500熒光定量PCR儀，熒光信號(hào)收集時(shí)設(shè)定為FAM熒光素，熒光信號(hào)收集 設(shè)在60 °C。
[0040] 6?結(jié)果判斷： HER2和內(nèi)參基因檢測(cè)參考值范圍均為：1X103拷貝/mL~lX10 8拷貝/mL(包括檢測(cè)下 限和檢測(cè)上限），樣本檢測(cè)可能出現(xiàn)以下情況： (1)如果HER2基因或者內(nèi)參基因檢測(cè)結(jié)果任意一項(xiàng)(或同時(shí)）小于1X103拷貝/mL，則 檢測(cè)結(jié)果無效，應(yīng)重新提取樣本核酸進(jìn)行檢測(cè)。
[0041] (2)如果HER2和內(nèi)參基因檢測(cè)濃度均在1X103拷貝/mL~lX10s拷貝/mL之間， 直接進(jìn)行以下計(jì)算并判讀結(jié)果。
[0042]M=HER2基因檢測(cè)濃度/內(nèi)參基因檢測(cè)濃度 當(dāng)M彡0. 2時(shí)，則結(jié)果判讀為：無HER2基因擴(kuò)增； 當(dāng)M>0. 2時(shí)，則結(jié)果判讀為：HER2基因擴(kuò)增。
[0043] (3)如果HER2基因或者內(nèi)參基因檢測(cè)結(jié)果任意一項(xiàng)（或同時(shí)）大于1 X 10s拷貝/ mL，則建議將樣本稀釋至線性范圍后重新測(cè)定，根據(jù)上面（2)的公式計(jì)算并判讀結(jié)果。
[0044] 利用上述方法對(duì)8例乳腺癌患者石蠟標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果藍(lán)色為HER2基因， 紅色為GAPDH基因，結(jié)果顯示，其中1、2和4號(hào)標(biāo)本HER2沒有擴(kuò)增，3、5、6、7和8號(hào)為HER2 擴(kuò)增(對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增曲線圖片請(qǐng)見附錄圖1)，該8例乳腺癌患者PCR檢測(cè)結(jié)果和FISH檢 測(cè)結(jié)果一致，證明了該試劑盒和FISH檢測(cè)技術(shù)具有很好的相關(guān)性。
[0045]表1
表中帶有E的數(shù)值為科學(xué)計(jì)數(shù)法表達(dá)，表示E前面數(shù)值乘以10的n次方，n為" + "后 面的數(shù)值。
[0046]實(shí)施例2 HER2/GAPDH定量標(biāo)準(zhǔn)品I-IV的構(gòu)建： (1)擴(kuò)增HER2和GAP