用于番茄灰霉病菌檢測的pcr引物及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及番茄灰霉病菌特異性PCR檢測引物及其檢測方法，專用于番茄灰霉病菌快速、靈敏和特異的分子檢測，同時可用于田間番茄灰霉病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術領域。
【背景技術】
[0002]由灰葡萄孢ciflerea)侵染引起的番前灰霉病是番前設施栽培中高危害、高損失且影響蔬菜產量、品質、安全的最主要病害之一。該菌可通過侵染番茄植株的葉片、莖桿、花和果實導致番茄灰霉病的發(fā)生，病原菌在土壤或病殘體上能以菌絲或菌核形式休眠越過冬天或夏天，溫濕度適宜時萌發(fā)形成大量的分生孢子后憑風雨飛散或借農事操作傳播引起番茄植株感病，發(fā)病處新生的灰霉分生孢子能夠進行重復再侵染，從而導致病情極易擴展和加重。在中國，番茄灰霉病一般年份造成20%左右的減產，嚴重時超過50%，甚至絕收，該病已在全國各地普通發(fā)生，且呈上升趨勢，成為當前番茄生產上的重要病害。因此，建立一套快速靈敏的檢測方法用于番茄灰霉病的早期診斷，防止其從發(fā)病區(qū)向未發(fā)病區(qū)傳播，對番茄灰霉病的及時控制具有重要意義。
[0003]自從發(fā)現(xiàn)番茄灰霉病菌以來，世界各國研究人員已對其檢測技術進行了研究，傳統(tǒng)的檢測方法是采用選擇性培養(yǎng)基從發(fā)病組織中分離病原菌，再對這些病原菌的形態(tài)特征等進行鑒定，或者利用肉眼和借助顯微鏡技術對發(fā)病癥狀進行判定。傳統(tǒng)的檢測方法不僅費時、準確度低，而且要求檢測人員具有豐富的經驗，不能滿足病害防治中病原菌準確、快速檢測的需求，易遺漏潛育期或隱癥的病害，以致延誤病害的防治，導致病害的暴發(fā)。因此，開發(fā)出快速靈敏、易操作、易普及的檢測方法對于控制病害具有十分重要的意義。
[0004]隨著分子生物學技術的發(fā)展，應用聚合酶反應(polymerase chain react1n,PCR)擴增技術對植物病原菌進行特異、靈敏的快速分子檢測的成功例子已越來越多。國內外已有研究人員利用真菌核糖體轉錄間隔區(qū)ITS (internal transcribed spacer)基因為病原菌檢測靶標，開發(fā)出了炭疽菌、疫霉菌、枯萎病菌、鏈格孢等不同病原真菌的特異性檢測引物，并利用特異性引物進行PCR擴增，達到病原菌快速、準確的檢測和鑒定。本發(fā)明通過對灰霉菌屬的ITS序列進行比對分析，設計出I對可用于特異性檢測番前灰霉病菌的PCR引物，為番茄灰霉病菌的準確鑒定和快速檢測提供技術和方法，有利于及早有效地采取防治措施。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中對番茄灰霉病菌檢測和鑒定主要基于形態(tài)學特征，方法耗時長、程序繁瑣、經驗性強、準確度低，難以做到對病害發(fā)生的及時監(jiān)測和控制病原菌的傳播、流行的問題，提供了一種用于番茄灰霉病菌特異性檢測的PCR引物及其檢測方法，利用本發(fā)明所述的PCR引物和檢測方法檢測番茄灰霉病菌準確性高、特異性強、靈敏度高、易于操作、檢測時間短且結果可靠。
[0006]實現(xiàn)本發(fā)明的目的包括下列步驟(技術方案):
1.通過測定番前灰霉病菌ciflerea)和其它灰霉病菌^acO的核糖體轉錄間隔區(qū)(ITS)基因，對灰霉菌屬不同種間ITS基因序列進行比對分析，根據(jù)番茄灰霉病菌ITS基因序列的特異位點設計出對番茄灰霉病菌具有特異性擴增作用的I對引物，即特異PCR檢測引物的序列為:
上游引物 BCF:5’ - GCTCGCCAGAGAATACCAAA -3’，
下游引物 BCR:5’- CCTACCTGATCCGAGGTCAA -3’ ；
對番茄灰霉病菌特異性擴增出386bp的產物。
[0007]2.番前灰霉病菌特異分子檢測方法的建立
(O提取待測樣品(帶菌的番茄植株組織或土壤等)基因組DNA。
[0008]用于檢測番茄植株組織是否存在番茄灰霉病菌時，采用NaOH快速裂解法提取番茄植株組織基因組DNA，具體過程如下:向1.0 mg番茄植株組織(花、葉或果實)中加入0.5mol/L NaOH 30 KL，將組織充分磨碎成糊后轉入1.5 mL離心管中，12，000 rpm離心6 min，取上清液5 μ?加入0.1 mol/L Tris-HCl (ρΗ=8.0)495μ?混合均勻，取1.0 μ?作為PCR模板進行擴增；
用于檢測土壤中是否存在番茄灰霉病菌時，采用土壤DNA提取法提取土壤中總微生物基因組DNA，具體過程如下:取已過200目篩的土壤冷凍抽干24-48 h后加入少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細粉分裝至1.5ml離心管中，每管加入500 μ?重量濃度為0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻，12，000 rpm離心15 min,取上清液加入等體積蛋白酶K緩沖液，加終濃度為lOPg/mL蛋白酶K，55°C水浴60min，水浴結束后，加入總體積1/2體積的7.5M NH4AC溶液，上下顛倒混勾，12，000 rpm離心15 min,吸上清液加2倍體積無水乙醇-20°C沉淀20min以上，沉淀結束后，12，000 rpm離心10 min，傾掉上清液，用體積濃度為70%乙醇洗滌沉淀，室溫涼干，每份樣品所提DNA用20 μ? TE (或無菌超純水)溶解，取1.0PL作為PCR模板進行擴增。
[0009](2 )以步驟(I)提取的DNA為模板，利用BCF/BCR這一對弓I物進行PCR擴增。PCR反應體系25 μ?，包括2Xrai7 PCR Master Mix (北京天根生化科技有限公司)12.5μ?，10MmoI/L的BCF/BCR引物各1.Ομ?, 1.0 μ? DNA模板，用無菌超純水補足至25 μ? ;擴增參數(shù)為:95 °C預變性5 min, 94 °C變性30 S，60 °C退火45 S，72 °C延伸30 S，共35個循環(huán)，最后 72 °C延伸 10 min。
[0010](3)取步驟(2)的PCR擴增產物5.0 μ?用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，4-5V/cm,電泳結束后經溴化乙錠染色于紫外燈下觀察，根據(jù)擴增產物的有無及其片段大小對結果進行判斷，如果能特異性地擴增出約386bp的產物，即可判斷所述的檢測樣品中存在番茄灰霉病菌，否則所述的檢測樣品中未存在番茄灰霉病菌。
[0011]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下的技術優(yōu)勢和有益效果:
1.特異性強、準確性高:本發(fā)明是根據(jù)真菌核糖體轉錄間隔區(qū)(internal transcribedspacer, ITS)序列種內的保守性和科屬種間可變性的特點，設計了對番茄灰霉病菌具有特異擴增作用的PCR引物，并已經對不同地理來源的番茄灰霉病菌和攜帶番茄灰霉病菌的樣品進行了測試驗證，只有番茄灰霉病菌和攜帶該病菌的樣品中能特異性地擴增出一條386bp的電泳條帶，說明本發(fā)明所設計的引物具有很強的特異性和準確性。
[0012]2.靈敏度高:病原菌傳統(tǒng)的檢測方法是通過分離、純化和形態(tài)學鑒定等步驟，這種傳統(tǒng)方法的成功需要發(fā)病組織中積累到足夠量的病原體才能成功。而本發(fā)明將設計的特異引物與ITS基因通用引物(ITS1/ITS4)聯(lián)合起來進行巢式PCR擴增后，對番茄灰霉病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到1fg，比常規(guī)PCR檢測提高了 10000倍；
3.實用性好:番茄灰霉病菌的快速檢測，具有重要的實際應用價值。傳統(tǒng)的檢測方法一般是在出現(xiàn)癥狀后，借助其發(fā)病癥狀，對病原菌進行分離、純化、鑒定等一系列繁瑣的過程，所需時間較長，給快速而精確地檢測病原物增加了難度，由于傳統(tǒng)的方法不能在病害發(fā)病前期及時進行田間的病原菌動態(tài)的監(jiān)測和檢測，時常延誤農業(yè)生產的防治時機。本發(fā)明可對植株和土壤樣品中是否存在番茄灰霉病菌進行檢測，如果能特異性地擴增出386bp的電泳條帶，說明樣品中存在該病菌，因此本發(fā)明可用于番茄灰霉病顯癥之前的早期監(jiān)測，可為確定病害防治最佳時期和制定防治策略的制定提供科學依據(jù)，因此本發(fā)明具有較好的實用性；
4.操作簡便、快速:應用本發(fā)明方法，對待測樣品基因組DNA進行提取、PCR擴增和常規(guī)的瓊脂糖電泳后即可判定結果，整個檢測過程采用DNA快速提取方法，操作簡單，無需對病原菌進行分離培養(yǎng)，大大縮短