與京海黃雞腹脂性狀顯著相關的特異SNPs分子標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于家禽育種領域，具體為根據(jù)基于第二代測序和簡化基因組測序的特異 性位點擴增片段測序（SpecificLocusAmplifiedFragmentSequencing,SLAF-seq)技術 對京海黃雞全基因組進行測序，利用生物信息學對測序數(shù)據(jù)進行分析，獲得大量的特異單 鏈核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism,SNPs)分子標記，將得到的SNPs與京 海黃雞腹脂性狀進行全基因組關聯(lián)分析，從而開發(fā)出1個與京海黃雞腹脂性狀顯著相關的 SNPs標記，利用生物信息學方法分析得到1個影響京海黃雞腹脂性狀的重要候選基因。這 些SNPs標記和候選基因不僅為京海黃雞腹脂性狀的分子標記輔助選擇提供了重要的理論 與素材基礎以及育種新思路，還為其他動物物種分子標記的開發(fā)提供了重要借鑒。
【背景技術】
[0002] 優(yōu)質雞是具有中國特色的地方品種肉雞，其肉質鮮美，風味獨特，被廣大消費者所 喜愛，肌肉的風味與脂肪含量密切相關。肉雞脂肪主要沉積在皮下、內臟（主要為腹脂、腸 胃周圍脂肪）以及肌肉與骨骼等部位，其中腹脂是脂肪沉積的主要部位。從養(yǎng)殖角度考慮， 腹脂和肌內脂肪直接影響肉雞的屠宰性狀和肉質性狀。其中，腹脂主要影響屠宰性狀，腹脂 過多會造成肉雞過肥，從而生產性能下降。因此，有必要對雞腹脂性狀進行遺傳改良，雖然 過去幾十年來采用傳統(tǒng)育種方法對腹脂性狀的遺傳改良取得了顯著的效果，然而腹脂性狀 為復雜數(shù)量性狀，受諸多基因的控制，如今，傳統(tǒng)育種方法已很難對腹脂性狀取得較大的遺 傳進展。目前，一種新的育種新方法逐漸在動物育種領域得到應用，即全基因組關聯(lián)分析 (Genome-wideAssociationStudy,GWAS)。全基因組關聯(lián)分析旨在從全基因組范圍內尋找 與性狀關聯(lián)的SNPs，得到的SNPs可用于分子標記輔助選擇。京海黃雞是在長期開展我國地 方雞種質資源調查、評價與保護的基礎上，經多年連續(xù)攻關成功培育而成的我國目前唯一 通過國家畜禽遺傳資源委員會審定的具有小型、優(yōu)質、早熟和抗逆四大特點的雞新品種，京 海黃雞的育成，即采用了常規(guī)育種方法，又采用了分子輔助選擇方法，是雞育種中理論與實 踐相結合的一個范例。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明利用SLAF-seq技術在京海黃雞全基因組范圍內獲得了 90961個SNPs標 記，結合全基因組關聯(lián)分析獲得了 1位于2號染色體上與京海黃雞腹脂性狀顯著相關的特 異性SNPs標記，生物信息學分析獲得了 1影響京海黃雞腹脂性狀的候選基因。
[0004] 本發(fā)明所述與京海黃雞腹脂性狀顯著相關的特異分子標記，是rs317160657,位于 14號染色體12246236bp處，突變類型為C/T突變，產生三種基因型，分別為AA、BB和AB。
[0005] 本發(fā)明還公開了京海黃雞14號染色體12246236bp位點作為與京海黃雞腹脂性狀 顯著相關的特異分子標記的應用。
[0006] 本發(fā)明進一些步公開了包含上述特異SNPs標記rs317160657的整聯(lián)蛋白重復蛋 白3(ITFG3)基因，位于14號染色體12244056-12262838bp，長18782bp?？勺鳛榫┖｜S雞 腹脂重的候選基因。用于擴增上述rs317160657SNPs標記位點的引物序列如SEQIDN0:1 和SEQIDNO:2 所示。
[0007] 本發(fā)明所述的SNPs標記獲取自400只京海黃雞核心群，樣本容量大，可靠性和準 確性高，不僅可用于京海黃雞腹脂多少的檢測，還可用于京海黃雞腹脂性狀的遺傳改良，為 京海黃雞腹脂性狀的分子標記輔助選擇提供了重要的理論和素材基礎。
[0008] 本發(fā)明所述的1候選基因分別包含上述SNPs，其為影響京海黃雞腹脂性狀的重要 基因，為控制腹脂性狀主效基因的篩選奠定了基礎。
[0009] 本發(fā)明利用SLAF-seq技術開發(fā)與京海黃雞腹脂性狀顯著相關的SNPs標記，具有 通量高、重復性好、精度高等特點，為雞乃至其他物種SNPs標記的開發(fā)提供了成功案例。
【附圖說明】
[0010] 圖1是京海黃雞腹脂重全基因組關聯(lián)分析的QQ-Plot圖。
[0011] 圖2是京海黃雞腹脂重全基因組關聯(lián)分析的曼哈頓圖。
【具體實施方式】
[0012] 實施例1
[0013] 1?試驗材料
[0014] 400只京海黃雞核心群母雞獲取自江蘇省南通市京海黃雞育種場，60日齡翅靜脈 采血1. 5ml，-20°C備用。43周齡屠宰分割，稱取腹脂重，腹脂重描述性統(tǒng)計結果見表1。
[0015] 表1京海黃雞腹脂重描述性統(tǒng)計
[0016]
[0017] 2.SLAF-seq技術方案設計
[0018]京海黃雞基因組DNA(多 6〇Ong)使用Dzup(Blood)GenomicDNAIsolation Reagent(上海生工生物工程有限公司）試劑盒提取，稀釋至50-100yg/iiL。利用 SLAF-seq技術對400只京海黃雞進行分型，具體方法如下：首先，利用酶切位點預測軟 件SLAF-Predict(Biomarker，Beijing，China)，根據(jù)原雞（Gallusgallus)基因組序列 的GC含量、重復序列以及基因特點預測酶切位點，設計標記開發(fā)方案，確定酶切方案、切 膠范圍、測序量等以其分子標記開發(fā)的密度、均勻性，從而確保達到預期的實驗目的。然 后，按照預先設計好的酶切方案，使用Haelll內切酶（NewEnglandBiolabs)酶切消化 基因組DNA，酶切后的片段在37°C條件下，使用克列諾片段（NEB)和dATP對末端添加一 個單核苷酸A堿基末端，使之與雙標記標簽測序接頭（PAGE純，LifeTechnologies)相 連。使用稀釋后的酶切-連接DNA樣本、dNTP、Q5高保真DNA聚合酶進行PCR反應，PCR 引物：AATGATACGGCGACCACCGA(SEQIDN0:3)和CAAGCAGAAGACGGCATACG(SEQIDN0:4) (PAGE純，LifeTechnologies)，PCR產物使用AgencourtAMPureXP玻璃珠（Beckman Coulter,HighWycombe,UK)純化并收集，用瓊脂糖凝膠電泳對收集后的片段大小進行選 擇，具體為切膠 500_800bp的片段，使用QIAquickGelExtractionKit(QIAGEN)回收，切 膠回收的產物建庫后使用IlluminaHiSeqTM2000進行測序。測序產生的雙端序列使用SO