基于焦磷酸測序的傳染性造血器官壞死病毒檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域中基于焦磷酸測序的傳染性造血器官壞死病毒檢測試 劑盒。
【背景技術】
[0002] 鯉春病毒血癥（SVC)、病毒性出血性敗血癥（VHS)、傳染性造血器官壞死?。↖HN) 是同被列為《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》的二類傳染病，SVC、 VHS和IHN分別是《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定的二類和三類疫病，這三種疫病都是 國際獸疫局0IE名錄中的重要疫病。
[0003]VHS困擾歐洲虹鱒魚達50多年，被認為是歐洲虹鱒魚養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失的頭號殺 手，VHS逐漸在其他品種中也有報道。這3種疫病均是由RNA病毒引起的急性高度傳染性疾 病，可侵害多種海水和淡水養(yǎng)殖魚類，在歐、美、日、韓及部分亞洲國家流行，可通過魚體及 所產卵、精液、尿、糞便以及污染的飼料、水等傳播，對養(yǎng)殖場造成致命打擊，危害非常嚴重。
[0004] 鯉春病毒血癥病毒（SVCV)引起包括鯉魚在內的很多水生動物的急性高度傳染性 疾??；傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)引起鮭科多種魚的致死性疾病，通過污染的水、飼 料和糞便等傳播，幼魚和魚苗死亡率可達100%，成魚感染可終身帶毒并散毒；病毒性出血 性敗血癥病毒（VHSV)可引起各種年齡的鮭科多種魚發(fā)病，死亡率達80-100%，特別是幼魚 和魚苗。
[0005]目前傳統(tǒng)的病毒分離及血清學診斷方法操作繁瑣，無法實現(xiàn)對不同亞型病毒的同 步檢測，RT-PCR方法也無法達到對病毒進行快速、準確、高通量檢測分型的目的，因而目前 急需一種能夠對SVCV、VHSV和IHNV進行高通量快速排查的集成化診斷技術。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是如何鑒定傳染性造血器官壞死病毒。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列 的物質在制備基于焦磷酸測序的傳染性造血器官壞死病毒檢測試劑或試劑盒中的應用。
[0008] 本發(fā)明所提供的檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質在制備基于焦磷 酸測序的傳染性造血器官壞死病毒檢測試劑或試劑盒中的應用中，所述傳染性造血器官壞 死病毒指紋序列為序列表中SEQIDNo. 9的第553-565位核苷酸。
[0009] 上述應用中，所述檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質可包括傳染性造 血器官壞死病毒指紋序列的測序引物和/或擴增傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的引 物對。
[0010] 上述應用中，所述測序引物可為名稱為IHNV-S的序列表中SEQIDNo. 12所示的 單鏈DNA;所述擴增傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的引物對可為名稱為IHNV-P的由序 列表中SEQIDNo. 10所示的單鏈DNA和SEQIDNo. 11所示的單鏈DNA組成的引物對。
[0011] 上述應用中，所述SEQIDNo. 10所示的單鏈DNA和/或SEQIDNo. 11所示的單 鏈DNA可用生物素標記。
[0012] 在本發(fā)明的一個實施例中，SEQIDNo. 11所示的單鏈DNA的5'端有生物素標記。
[0013] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了基于焦磷酸測序的傳染性造血器官壞死病 毒檢測試劑或試劑盒。
[0014] 本發(fā)明所提供的基于焦磷酸測序的傳染性造血器官壞死病毒檢測試劑或試劑盒， 包括檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質；所述傳染性造血器官壞死病毒指紋序 列為序列表中SEQIDNo. 9的第553-565位核苷酸。
[0015] 上述試劑或試劑盒中，所述檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質可包括 傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的測序引物和/或擴增傳染性造血器官壞死病毒指紋 序列的引物對。
[0016] 上述試劑或試劑盒中，所述測序引物可為名稱為IHNV-S的序列表中SEQIDNo. 12 所示的單鏈DNA;所述擴增傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的引物對可為名稱為IHNV-P 的由序列表中SEQIDNo. 10所示的單鏈DNA和SEQIDNo. 11所示的單鏈DNA組成的引物 對。
[0017] 上述試劑或試劑盒中，所述SEQIDNo. 10所示的單鏈DNA或SEQIDNo. 11所示 的單鏈DNA可用生物素標記。
[0018] 在本發(fā)明的一個實施例中，SEQIDNo. 11所示的單鏈DNA的5'端有生物素標記。
[0019] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了基于焦磷酸測序的傳染性造血器官壞死病 毒檢測試劑或試劑盒的制備方法。
[0020] 本發(fā)明所提供的基于焦磷酸測序的傳染性造血器官壞死病毒檢測試劑或試劑盒 的制備方法中，所述基于焦磷酸測序的傳染性造血器官壞死病毒檢測試劑或試劑盒為上文 所述基于焦磷酸測序的傳染性造血器官壞死病毒檢測試劑或試劑盒；所述基于焦磷酸測序 的傳染性造血器官壞死病毒檢測試劑或試劑盒的制備方法，包括將所述測序引物和/或所 述擴增傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的引物對的兩條單鏈DNA獨立包裝的步驟。
[0021] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的 物質。
[0022] 本發(fā)明所提供的檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質，為上述應用中或 上述試劑或試劑盒中所述檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質。
[0023] 上述檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質，可包括下述P1和/或P2:
[0024]P1、所述傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的測序引物；
[0025]P2、所述擴增傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的引物對。
[0026] 上述檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質中，所述測序引物可為名稱為 IHNV-S的序列表中SEQIDNo. 12所示的單鏈DNA;所述擴增傳染性造血器官壞死病毒指紋 序列的引物對可為名稱為IHNV-P的由序列表中SEQIDNo. 10所示的單鏈DNA和SEQID No. 11所示的單鏈DNA組成的引物對。
[0027] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了傳染性造血器官壞死病毒的檢測方法1。
[0028] 本發(fā)明所提供的傳染性造血器官壞死病毒的檢測方法1，包括下述H1)和H2)的步 驟：
[0029]H1)以待測生物樣品的核酸（RNA或DNA)為模板，選用54°C的退火溫度，用所述 IHNV-P進行PCR擴增得到PCR產物；
[0030] H2)檢測步驟HI)得到的PCR產物的大小，如果所述PCR產物中含有61bp的DNA 片段，所述待測樣品含有傳染性造血器官壞死病毒或候選含有傳染性造血器官壞死病毒； 如果所述PCR產物中不含61bp的DNA片段，所述待測樣品不含傳染性造血器官壞死病毒或 候選不含傳染性造血器官壞死病毒。
[0031] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了傳染性造血器官壞死病毒的檢測方法2。
[0032] 本發(fā)明所提供的傳染性造血器官壞死病毒的檢測方法2,包括下述H3)和H4)的步 驟：
[0033]H3)以待測生物樣品的核酸（RNA或DNA)為模板，選用54°C的退火溫度，用所述 IHNV-P進行PCR擴增得到PCR產物；
[0034]H4)檢測步驟H3)得到的PCR產物，如果所述PCR產物中含有所述傳染性造血器官 壞死病毒指紋序列，所述待測樣品含有傳染性造血器官壞死病毒或候選含有傳染性造血器 官壞死病毒；如果所述PCR產物中不含所述傳染性造血器官壞死病毒指紋序列，所述待測 樣品不含傳染性造血器官壞死病毒或候選不含傳染性造血器官壞死病毒。
[0035] 上述傳染性造血器官壞死病毒的檢測方法2中，所述檢測步驟H3)得到的PCR產 物為以所述IHNV-S為測序引物進行焦磷酸測序。
[0036] 上文中，所述檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質可只由所述IHNV-S 和所述IHNV-P組成，也可只由所述IHNV-P組成，也可只由所述IHNV-S組成。
[0037] 上文中，所述檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質，還可包括檢測所述 傳染性造血器官壞死病毒指紋序列所需要的其他試劑和/或儀器，如通過焦磷酸測序檢測 所述傳染性造血器官壞死病毒指紋序列所需的試劑和儀器。
[0038] 具體來說，進行焦磷酸測序所需要的其它試劑和儀器可為5XPCRbuffer和/或 Taq熱啟動酶和/或變性緩沖液（denatureationbuffer)和/或沖洗緩沖液（washing buffer)和/或鏈霉親和素包被的磁珠和/或真空吸附栗（vacuumpreptool)和/或PCR 儀和/或PYROMARKID儀器。
[0039] 其中，所述5XPCR buffer和所述Taq熱啟動酶均可為寶生物工程（大連）有限 公司產品，貨號為DRR019A);
[0040] 所述鏈霉親和素包被的磁珠可為北京思爾成生物技術有限公司的貨號為142-03 的Dynatreads?M_280Tosylactivated〇
[0041] 所述真空吸附栗（vacuumpreptool)可為德國QIAGEN產品。
[0042] 所述變性緩沖液（denatureationbuffer)可為為德國QIAGEN產品，貨號為 19083。
[0043] 所述沖洗緩沖液（washingbuffer)可為德國QIAGEN產品，貨號為19086。
[0044] 上述檢測傳染性造血器官壞死病毒指紋序列的物質均可獨立包裝。
[0045] 實驗證明，基于本發(fā)明的傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)指紋序列，可利用本發(fā) 明的檢測傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)指紋序列的物質通過焦磷酸測序法對傳染性造 血器官壞死病毒進行鑒定，其中IHNV-P可擴增出含有IHNV指紋序列的DNA片段，IHNV-S可 通過焦磷酸測序法測定IHNV指紋序列的序列；本發(fā)明的IHNV-P和IHNV-S可特異識別傳染 性造血器官壞死病毒的核酸序列；本發(fā)明的IHNV-P具有較高的靈敏度，可識別濃度為1拷 貝/yL的傳染性造血器官壞死病毒。依賴于本發(fā)明的IHNV指紋序列及IHNV-P與IHNV-S的鑒定IHNV的焦磷酸測序法與普通PCR鑒定IHNV的結果是一致的，并可避免普通PCR鑒定 IHNV時的假陽性的問題；常規(guī)的DNA測序技術對大片段的DNA進行序列測定速度慢、消耗 大，更不易于進行大規(guī)模樣本的檢測，而依賴于本發(fā)明的IHNV-P與IHNV-S的鑒定IHNV的 焦磷酸測序法則可克服這一缺點，可快速檢測大規(guī)模樣本，在4小時內即可完成檢測過程。 實驗證明，與普通PCR鑒定IHNV相比，依賴于本發(fā)明的IHNV指紋序列及IHNV-P與IHNV-S 的鑒定IHNV的焦磷酸測序法具有自動化程度高、準確性高、靈敏度高、可靠性好、重復性 好、穩(wěn)定性好、操作簡便、耗時短、高通量、成本低的特點。
【附圖說明】
[0046] 圖1為PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道M為DL2000Marker;泳道1為 用SVCV-P以SVCV的RNA為模板的PCR擴增產物的電泳