有關癌癥發(fā)展及對治療的反應的快速預測的制作方法
【專利說明】有關癌癥發(fā)展及對治療的反應的快速預測
[0001]相關串請的交叉引用
[0002]本申請要求2012年12月2日提交的美國臨時申請?zhí)?1/732，375的權益，該案部分以引入的方式并入本文中。
技術領域
[0003]本發(fā)明涉及一種通過注射人類腫瘤細胞在斑馬魚中產(chǎn)生腫瘤的方法。本發(fā)明還涉及在斑馬魚中產(chǎn)生的人類腫瘤的用途，所述腫瘤是用于表征腫瘤細胞、測試藥物及用于個體化醫(yī)療。本發(fā)明大體上還涉及一種多孔顯微注射系統(tǒng)，并且更確切地說，涉及一種用于斑馬魚胚胎的多孔顯微注射系統(tǒng)。
【背景技術】
[0004]細胞中信號轉(zhuǎn)導的適當調(diào)控會引起多種生物功能，包括正常細胞復制、生長、細胞生理學和細胞死亡。細胞中正常信號轉(zhuǎn)導的任何擾動都會在體內(nèi)引起各種疾病狀態(tài)，并且疾病狀態(tài)通常是涉及到超過一種細胞類型以及整個身體的生理學狀態(tài)的結(jié)果。確切地說，就癌癥而言，這一情形尤其復雜，因為涉及到人體的許多潛在的發(fā)炎性狀態(tài)。不同的發(fā)炎性病況，如肥胖、過敏、關節(jié)炎及糖尿病，都在癌癥發(fā)展和治療可能起到的作用方面發(fā)揮巨大作用。因此，建立模擬如癌癥等復雜病況的體內(nèi)模型需要具有活性免疫系統(tǒng)的動物模型。如果沒有活性免疫系統(tǒng)，那么將無法完全復制在癌癥中所觀察到的動態(tài)細胞異質(zhì)性。此外，對于此類癌癥動物模型的臨床有用性，尤其是在預測每一個體的癌癥、器官侵襲和身體其它部分的癌細胞轉(zhuǎn)移的生物學方面的有用性，應當有一種方式能在極短時間(在化學療法開始之前)內(nèi)模擬個別患者的癌癥并且預測癌細胞對治療的反應。
[0005]對于基于上皮的癌癥，如乳癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌及胰臟癌來說，針對此類轉(zhuǎn)移性腫瘤的焦點療法是至關重要的。遠端轉(zhuǎn)移性IV期癌癥的侵襲性呈現(xiàn)極低的存活率(seer, cancer, gov)。
[0006]轉(zhuǎn)移性癌癥涉及侵襲性惡性細胞從原發(fā)腫瘤脫離而進入血流和/或淋巴管中。這些循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)設法到達遠端器官，在這些器官中，它們產(chǎn)生繼發(fā)性轉(zhuǎn)移。相應地，這些CTC的存在伴隨著不良預后(巴里克M(Balic Μ),威廉姆A(ffilliams Α),林 H(Lin H),達塔 R(Datar R)，科特 RJ.(Cote RJ.) (2012).循環(huán)腫瘤細胞:從實驗室到病床(Circulating Tumor Cells:From Bench to Bedside),《醫(yī)學年評》(Annu Rev Med.)，2012 年 10 月 18 日)。
[0007]轉(zhuǎn)移性疾病患者的治療在很大程度上仍取決于從原發(fā)腫瘤獲得的信息，盡管常常在原發(fā)腫瘤上觀察到的生物標記物與在繼發(fā)性腫瘤上觀察到的那些生物標記物之間存在不一致(新倉直樹(Naoki Niikura),劉軍(Jun Liu),林直樹(Naoki Hayashi),伊麗莎白A.米特多夫(Elizabeth A.Mittendorf)，H云(YunGong),夏娜 L.帕拉(Shana L.Palla),德田豐(Yutaka Tokuda),安娜M.同薩雷斯-安古羅(Ana M.Gonzalez-Angulo),加布雷爾 N.霍托巴奇(Gabriel N.Hortobagyi)及直人 Τ.上野(Naoto T.Ueno) (2011);過表達人表皮生長因子受體2 (HER2)的原發(fā)乳房腫瘤的轉(zhuǎn)移部位中HER2表達的缺失(Lossof Human Epidermal Growth Factor Receptor 2(HER2)Express1n in MetastaticSites of HER2_0verexpressing Primary Breast Tumors.),《臨床腫瘤學雜志》(J ClinOncol), 30:593-599 ;都彭特杰森 J (Dupont Jensen J)，拉克霍姆 AV(Laenkholm AV),克奴普 A(Knoop Α),艾沃茲 M(Ewertz Μ),班達魯 R (Bandaru R),劉 W (Liu ff),哈克 W(Hackl ff),巴瑞特JC(Barrett JC),加德納H.(Gardner H.)(2011) ;PIK3CA突變可能在原發(fā)乳癌與其相應轉(zhuǎn)移性疾病之間不一致(PIK3CA mutat1ns may be discordant between primaryand corresponding metastatic disease in breast cancer.),〈〈臨床癌癥石開究〉〉(ClinCancer Res.) 17:667-77)。作為根據(jù)情況得到的繼發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移的起源，應了解，繼發(fā)性腫瘤的生物學將為晚期癌癥患者的個體化治療增添新的視角。為了支持這一假說，已經(jīng)關于若干癌癥類型證實CTC在預后方面的重要性(克里斯托法力M(CriStofanilli M)，布德GT ((Budd GT),艾利斯MJ (Ellis MJ),斯托派克 A (Stopeck A)，馬特拉 J (Matera J)，米勒MC(Miller MC),魯本 JM(Reuben JM),多伊爾 GV(Doyle GV),艾拉德 WJ(Allard WJ),特斯塔彭LW(Terstappen Lff),哈耶斯DF.(Hayes DF.) (2004);在轉(zhuǎn)移性乳癌中的循環(huán)腫瘤細胞、疾病發(fā)展及存活情況(Circulating tumor cells, disease progress1n, and survivalin metastatic breast cancer.),《新英格蘭醫(yī)學雜志》(N Engl J Med.) 351:781-91 ;莫倫諾 JG (Moreno JG),米勒 MC (Miller MC),格羅斯 S (Gross S)，艾拉德 WJ (Allard WJ)，蓋米拉LG(Gomella LG),特斯塔彭LW(Terstappen LW).(2005);循環(huán)腫瘤細胞預測轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的存活率(Circulating tumor cells predict survival in patientswith metastatic prostate cancer.),《泌尿?qū)W》(Urology) 65:713-8 ;克漢 SJ (CohenSJ),龐特 CJ (Punt CJ),伊安諾提 N (Iannotti N),塞德曼 BH (Saidman BH)，薩巴斯KD (Sabbath KD),加布埃爾 NY(Gabrail NY),皮卡斯 J(Picus J),莫斯 MA(Morse MA),米歇爾 E(Mitchell E)，米勒 MC(Miller MC),多伊爾 GV(Doyle GV),提辛格 H(TissingH),特斯塔彭LW(Terstappen Lff),米羅普NJ(Meropol NJ).(2009);轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者中循環(huán)腫瘤細胞的預后重要性(Prognostic significance of circulatingtumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.)《月中瘤學年干ll》(AnnOncol.)20:1223-9 ;克雷布斯 MG (Krebs MG),索蘭 R(Sloane R)，普雷斯特 L (Priest L)，蘭卡夏 L (Lancashire L),侯 JM(Hou JM),格蕾絲托克 A (Greystoke A),沃德 TH (Ward TH),法拉德奇 R(Ferraldeschi R),古月吉斯 A(Hughes A),科拉克 G(Clack G),拉森 M(RansonΜ),戴維C(Dive C)，布拉克霍H1.(Blackhall FH.) (2011);非小細胞肺癌患者中循環(huán)腫瘤細胞的評價和預后重要性(Evaluat1n and prognostic significance of circulatingtumor cells in patients with non-small-cell lung cancer.)《臨床月中瘤學雜志》(JClin Oncol.)29:1556-63)。
[0008]癌細胞的分子和基因組特征分析已經(jīng)成為靶向療法和腫瘤學研究的新趨勢。然而，癌細胞的分子異質(zhì)性及其常常改變的性質(zhì)的關聯(lián)性、原發(fā)腫瘤以及CTC的分子標簽的關聯(lián)性是有限的(鮑威爾AA (Powell AA),塔拉薩斯AH(Talasaz AH), ^ H (Zhang H),克拉姆MA(Coram MA),雷迪A(Reddy A)等人，(2012)，循環(huán)腫瘤細胞的單細胞特征分析:乳癌細胞系中的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性和多樣性(Single Cell Profiling of Circulating TumorCelIs:Transcript1nal Heterogeneity and Diversity from Breast Cancer CellLines.)《公共科學圖書館綜合期刊》(PLoS ONE) 7: e33788)。
[0009]癌細胞的分子和基因組特征分析極為重要，因為它可以提供針對個體的特定癌癥的靶向療法。然而，原發(fā)腫瘤的特征分析無法呈現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性CTC中出現(xiàn)的分子變化。轉(zhuǎn)移性繼發(fā)性腫瘤的靶向治療需要的是一種對CTC進行特征分析的方式。然而，在患者的血液中存在極少的CTC，因此，很難分離和表征這些細胞。此外，在患者的血液中分離少量CTC的應用也有限，除非這些細胞可以繁殖并進行檢查。使CTC在組織培養(yǎng)物中生長是可行的，不過體外培養(yǎng)不能完全呈現(xiàn)細胞特征，具體地說，其侵襲正常組織并形成三維腫瘤，以及募集生長因子和血管的能力。
[0010]斑馬魚(Dan1 rer1 ;一種常用的淡水水族箱魚)，是一種重要的模型生物體，并且越來越多地用于科學研究中(雷薩科(Lieschke)和科瑞(Currie) (2007) “人類疾病的動物模型:斑馬魚(Animal models of human disease:zebrafish swims into view.)，，《自然評論:遺傳學》(Nature Reviews Genetics)8:353-367)。在醫(yī)學上，常常將斑馬魚用于胚胎發(fā)生研究、心血管研究、神經(jīng)元發(fā)育及視網(wǎng)膜再生中，而且近期還將其確立為幾乎每類癌癥的重要模型(斯托勒托夫(Stoletov)和克萊蒙科(Klemke) (2008) “今日焦點:斑馬魚作為人類癌癥模型(Catch of the day: zebraf ish as a human cancer model.) ”《癌基因》(Oncogene) 27:4509-4520)。
[0011]斑馬魚對致癌化學試劑起反應并形成與人體中所見極其類似的贅瘤(拜克維斯(Beckwith)等人(2000) “乙基亞硝基脲在斑馬魚(Dan1 rer1)中誘發(fā)瘤形成(Ethylnitrosourea induces neoplasia in zebraf ish (Dan1 rer1).)，，〈〈實驗室石開究》(Lab Invest.)80(3):379-385)。它還是癌癥遺傳學的最佳模型(斯特恩(Stern)和祖恩(Zon) (2003).“斑馬魚中的癌癥遺傳學和藥物發(fā)現(xiàn)(Cancer genetics and drugdiscovery in the zebraf ish.)，，《自然評論:癌癥》(Nature Rev.Cancer) 3:533-539)。在斑馬魚體內(nèi)基因操作的簡易性有助于其成為了解血管生成、細胞凋亡和轉(zhuǎn)移的優(yōu)良模型(薩博迪迦(Serbedija)等人(1999) “斑馬魚血管生成:一種新穎的藥物篩選模型(Zebrafish ang1genesis: a novel model for drug screening.)，，；《血管生成〉〉(Ang1genesis) 3:353-359 ;帕恩格(Pa