八微米的直徑。通常，調(diào)節(jié)速率以使得在相鄰的填充的小滴之間有10個空的小滴。 隨后，使5的流沿具有相同直徑的第二微流體管以1000滴/秒的速率前進(jìn)至第二室6,第二 個五微米水性球形小滴7的流通過第二小滴頭8進(jìn)入第二室6中。使得小滴5和7以連續(xù) 的方式合并，從而形成直徑約九微米的放大的水性小滴9。7中的每個含有焦磷酸酶用以破 壞存在于5中的每個中的任何殘留的焦磷酸根陰離子。
[0059] 然后9的流以相同速率前進(jìn)，通過微流體管道，進(jìn)入第三室10,在那里，這些小滴 與通過相應(yīng)小滴頭12同樣進(jìn)入其中的第三個五微米水性球形小滴11的流相接觸。9中的 每個在室6和10之間移動所需的時間為大約2分鐘。
[0060] 隨后使得小滴9和11在10中合并，從而產(chǎn)生小滴13(直徑大約十微米）。11中 的每個包含嗜溫連接酶和包含成對的四個j形的第一寡核苷酸和四個相應(yīng)的第二單鏈寡 核苷酸的捕獲系統(tǒng)。各j形的第一寡核苷酸的長度為60個核苷酸堿基并且通過以下方式 制備：繞自5'末端起第45個核苷酸堿基折疊60個核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸前體，以產(chǎn) 生3核苷酸單鏈環(huán)，12核苷酸堿基對雙鏈區(qū)域和不同于四種第一寡核苷酸中的每一個的33 核苷酸堿基單鏈區(qū)域。這四種第一寡核苷酸中的每一個也具有以DNA的四種特征核苷酸堿 基類型（即A、T、G和C)為特征的不同的第33個堿基（從單鏈末端測量的）。所述四種不 同的第二寡核苷酸各自的長度為28個核苷酸堿基并且具有與由其第一寡核苷酸對的第4 和第32個核苷酸堿基限定的單鏈區(qū)域的部分互補(bǔ)的不同序列。
[0061] 接著13的流以相同速率前進(jìn)，通過微流體管道，在那里三十分鐘后，其通過熱點， 在所述熱點處，使得連接酶失活（十至二十分鐘），之后進(jìn)入第三室14,在那里，使得其與通 過小滴頭16同樣進(jìn)入其中的第四個五微米水性球形小滴15的流合并。15中的每個含有對 各第二寡核苷酸具有選擇性的四種不同的引物對，Taq Pol酶，DNA的特征性的四種脫氧核 糖核苷酸三磷酸和對可以由能夠在13中產(chǎn)生的四種不同的捕獲的分子產(chǎn)生的四種類型的 擴(kuò)增子具有選擇性的四種不同的分子信標(biāo)。15還可以包含通常用于進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)的其 它添加劑。隨后使這樣形成的合并的微滴17的流經(jīng)歷60至95°C的20至30個熱循環(huán)（大 約每分鐘一個循環(huán)），在此期間，解鏈的捕獲分子的擴(kuò)增通過聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)生。在此時期 最后，將17轉(zhuǎn)至檢測系統(tǒng)。
[0062] 檢測系統(tǒng)（未顯示）通常包括檢測窗，其中用來自激光的入射光檢查各小滴。該 光的作用隨后導(dǎo)致每個小滴中激活的分子信標(biāo)，從而以原來被結(jié)合到捕獲的分子中的單核 苷酸堿基的特征性的方式發(fā)熒光（或者如果小滴原來是空的，則基本上根本不發(fā)熒光）。隨 后在上文提到的四個分子信標(biāo)的四個特征波長處檢測該熒光是否存在。因此，當(dāng)小滴被檢 查時，相應(yīng)地，可以實際上讀出原來的多核苷酸分析物中的核苷酸堿基的序列。盡管熒光的 發(fā)生通常是快速的，僅在逝去十分鐘后檢查各小滴，以保證可靠地鑒定出空的小滴。
【主權(quán)項】
1. 用于確定多核苷酸分析物中核苷酸堿基的序列的方法，其特征在于以下步驟：（1) 由所述分析物產(chǎn)生單核苷酸堿基流；（2)通過將各單核苷酸堿基與捕獲系統(tǒng)反應(yīng)來產(chǎn)生捕 獲的分子；（3)擴(kuò)增至少部分的所述捕獲的分子，從而產(chǎn)生以所述單核苷酸堿基為特征的 多個擴(kuò)增子；(4)利用具有特征可檢測元件的相應(yīng)探針標(biāo)記所述擴(kuò)增子，和（5)檢測所述可 檢測元件的性質(zhì)特征。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述流中核苷酸堿基的排序?qū)?yīng)于所述 分析物中的核苷酸堿基序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，對于各個類型的核苷酸堿 基，所述捕獲系統(tǒng)由兩個組分構(gòu)成；(a)包含雙鏈區(qū)域和單鏈區(qū)域的第一寡核苷酸和（b)第 二單鏈寡核苷酸，所述第二單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列與所述第一寡核苷酸的單鏈區(qū) 域的核苷酸堿基序列至少部分互補(bǔ)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述捕獲系統(tǒng)包含用于各個 類型的核苷酸堿基的單寡核苷酸，所述單寡核苷酸包含單鏈核苷酸區(qū)域，所述單鏈核苷酸 區(qū)域的末端與兩個不同的雙鏈寡核苷酸區(qū)域連接。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（1)中的單核苷酸堿基 流通過所述分析物的逐步焦磷酸解而獲得。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（1)中的單核苷酸堿基 流通過核酸外切酶對所述分析物的作用，或聚合酶對所述分析物的核酸外切酶作用，以及 激酶對所述分析物的作用而獲得。7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，多核苷酸分析物被結(jié)合到表 面。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶在步驟（1)的反應(yīng)條件下不呈現(xiàn)核 酸外切酶或核酸內(nèi)切酶行為。9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（1)在包含所述酶、焦磷 酸根陰離子和鎂陽離子的流動水性介質(zhì)的存在下在非平衡條件下進(jìn)行，并且其中所述單核 苷酸堿基被連續(xù)地從產(chǎn)生它們的反應(yīng)區(qū)處移走。10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟⑴和⑵之間，通過 焦磷酸酶破壞任何殘留的焦磷酸根陰離子。11. 根據(jù)權(quán)利要求3和5至10中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸是 j形的。12. 根據(jù)權(quán)利要求3和5至11中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸的 總長為20至100個核苷酸堿基。13. 根據(jù)權(quán)利要求3和5至12中任一項所述的方法，其特征在于，所述捕獲系統(tǒng)包含四 種不同的第二寡核苷酸類型，其各自具有與四種不同的第一寡核苷酸中的四種不同的單鏈 區(qū)域中的一個的部分互補(bǔ)的序列。14. 根據(jù)權(quán)利要求4、5至10和13中任一項所述的方法，其特征在于，各雙鏈寡核苷酸 區(qū)域由10至30個核苷酸對構(gòu)成。15. 根據(jù)權(quán)利要求4、5至10、13和14中任一項所述的方法，其特征在于，使用兩個分離 的雙鏈寡核苷酸區(qū)域，其各自包含遠(yuǎn)離閉環(huán)的單鏈核苷酸區(qū)域的末端。16. 根據(jù)權(quán)利要求4、5至10、13至15中任一項所述的方法，其特征在于，所述雙鏈寡核 苷酸區(qū)域能夠通過將末端回折于其上以留下包含所述單鏈核苷酸區(qū)域的缺口而來源于單 鏈寡核苷酸前體。17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述捕獲系統(tǒng)包含至少兩種 不同的捕獲系統(tǒng)類型，各類型對不同核苷酸堿基具有選擇性。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，分析物是DNA或RNA，并且所述捕獲系 統(tǒng)包含不同的四組捕獲分子，各組對其特征核苷酸堿基中的一個具有選擇性。19. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（3)和（4)同時進(jìn)行。20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（3)中的擴(kuò)增使用選自 聚合酶鏈反應(yīng)、重組酶聚合酶擴(kuò)增和滾環(huán)擴(kuò)增的方法來進(jìn)行。21. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（2)使用連接酶，所述 連接酶在步驟（4)發(fā)生之前被失活。22. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（4)中使用的探針選自 分子信標(biāo)、Taqman探針和蝎型探針。23. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（5)包括檢測由激活的 探針上的熒光團(tuán)發(fā)出的熒光。24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（1)至（5)中的至少一 個在微滴中進(jìn)行。25. 用于確定多核苷酸分析物中核苷酸堿基的序列的裝置，其特征在于，所述裝置適于 使用根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于確定多核苷酸分析物中核苷酸堿基的序列的方法。其特征在于以下步驟：(1)由所述分析物產(chǎn)生單核苷酸堿基流；(2)通過將各單核苷酸堿基與捕獲系統(tǒng)反應(yīng)產(chǎn)生捕獲的分子；(3)擴(kuò)增所述捕獲的分子的至少部分，從而產(chǎn)生以所述單核苷酸堿基為特征的多個擴(kuò)增子；(4)利用具有特征可檢測元件的相應(yīng)探針標(biāo)記所述擴(kuò)增子，和(5)檢測所述可檢測元件的性質(zhì)特征。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105121662
【申請?zhí)枴緾N201480020411
【發(fā)明人】卡梅倫·亞歷山大·弗雷林, 巴納比·巴姆福思, 布魯諾·弗拉維奧·諾蓋拉·德·索薩·蘇亞雷斯, 托馬斯·亨利·艾薩克, 鮑里斯·布賴納, 亞歷山德拉·納塔萊, 米歇爾·阿馬西奧, 保羅·迪爾
【申請人】貝斯4創(chuàng)新公司, 醫(yī)藥研究委員會
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2014年4月9日
【公告號】CA2907868A1, EP2828409A1, EP2828409B1, WO2014167324A1