從全緣葉綠絨蒿花中同時(shí)分離純化多種黃酮類(lèi)成分的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從全緣葉綠絨蒿花中同時(shí)分離純化多種黃酮類(lèi)成分的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 全緣葉綠絨蒿Meconopsisintegrifolia(Maxim.)Franch?為罌粟科 (Papaveraceae)綠絨蒿屬（Meconopsis)植物，為傳統(tǒng)藏藥材，在我國(guó)主要分布于西藏、四 川、云南、青海、甘肅等省區(qū)?！毒е楸静荨酚涊d全緣葉綠絨蒿以花入藥，用于治療肝炎、肺炎 和水腫 [12]。現(xiàn)代化學(xué)成分研究對(duì)全緣葉綠絨蒿的地上部分的化學(xué)成分進(jìn)行了較系統(tǒng)的研 究，采用傳統(tǒng)分離方法分離得到了生物堿和黃酮等化合物 [3 5]。而藏醫(yī)藥書(shū)籍記載全緣葉綠 絨蒿以花入藥，未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)全緣葉綠絨蒿花的化學(xué)成分進(jìn)行研究。并且，綠絨蒿屬 植物的化學(xué)成分多采用硅膠柱色譜、中壓柱層析、制備液相、SephadexLH-20等傳統(tǒng)分離方 法進(jìn)行分離[3 7]，因此，簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好的分離制備純化合物的方法在該屬植物中將會(huì) 受到越來(lái)越多的關(guān)注。
[0003] 高速逆流色譜（High-speedcounter-currentchromatography,HSCCC)技術(shù)依據(jù) 化合物在互不相溶的兩相溶劑中的分配系數(shù)的差異而實(shí)現(xiàn)分離。不需要固體載體，可避免 樣品在分離過(guò)程中的不可逆吸附和分解，溶劑系統(tǒng)的極性可根據(jù)化合物的性質(zhì)選擇，選擇 范圍廣，適合各種極性的化合物，并且分析時(shí)間較短，回收率和產(chǎn)品純度高，適宜放大，便于 工業(yè)化生產(chǎn)，可有效用于分離制備天然產(chǎn)物[s1(：]。
[0004] Zhou等[11]報(bào)道，全緣葉綠絨蒿地上部分70 %乙醇提取物有較好的肝保護(hù)作用。 目前還未見(jiàn)通過(guò)HSCCC法對(duì)全緣葉綠絨蒿花中黃酮類(lèi)成分的分離純化研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供從全緣葉綠絨蒿中同時(shí)分離純化不同黃酮類(lèi)成分的方法。
[0006] 本發(fā)明提供了從全緣葉綠絨蒿花中同時(shí)分離純化4種黃酮類(lèi)成分的方法，它包括 如下操作步驟：
[0007] (1)取罌粟科綠絨蒿屬植物全緣葉綠絨蒿M.integrifolia(Maxim. )Franch.的 花，粉碎，以60~70%v/v乙醇為溶劑進(jìn)行提取，收集醇提液，減壓回收乙醇，依次用水-乙 酸乙酯溶劑系統(tǒng)和水-正丁醇溶劑系統(tǒng)萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，除去溶劑后， 所得殘?jiān)礊榇痔嵛铮?br>[0008] (2)取乙酸乙酯：正丁醇：水=2:3:5v/V/V，充分振搖，靜置分層，以上相為固定 相，下相為流動(dòng)相，將固定相充滿分離螺旋管，柱溫30~35°C，主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為890~ 920r/min，然后以2mL/min的流速栗入流動(dòng)相，至兩相溶劑在管柱中達(dá)到平衡狀態(tài)；將步驟 ⑴制備的粗提物，以下相為溶劑溶解，制備樣品溶液，將樣品溶液進(jìn)樣，在254nm下監(jiān)測(cè)， 依次收集出峰時(shí)間為250~280min、300~320min、360~90min、420~450min的目標(biāo)成 分，即依次得到化合物1~4,各化合物結(jié)構(gòu)式如下：
[0009]
[0010] 溶劑體系的選擇是高速逆流色譜分離（HSCCC)中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，需根據(jù)待分離 物質(zhì)的理化性質(zhì)，選擇合適的溶劑體系。分配系數(shù)是HSCCC分離的一個(gè)重要參數(shù)，是篩選溶 劑體系的參考依據(jù)之一，理想的分配系數(shù)為〇. 5~2,K值太大使譜帶增寬，K值太小則峰無(wú) 法分離[12 13]。本發(fā)明采用UPLC法測(cè)定溶劑體系的K值，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0011] 表1化合物1~4在不同溶劑系統(tǒng)中的K值
[0012]
[0013] 從表1可以看出，氯仿/甲醇/水體系（4:3:2)中目標(biāo)化合物的K值太大，不適合 分離，故嘗試選擇乙酸乙酯/正丁醇/水體系。結(jié)果表明，不同體積溶劑配比中，乙酸乙酯 / 正丁醇 / 甲醇 / 水體系（4:1:0.5:5,v/v/v/v)盡管K值（1.K= 0.58 ;2.K= 0.82 ;3.K =1. 38 ;4.K= 1. 26)合適，但實(shí)際分離中目標(biāo)峰的分離效果并不好，峰未分開(kāi)，四個(gè)峰被 一起沖出。故考慮通過(guò)增大K值的方式使出峰時(shí)間延緩，試驗(yàn)是否能使峰達(dá)到分離的目的。 減少乙酸乙酯的體積，增大正丁醇的體積，當(dāng)采用溶劑體系為乙酸乙酯/正丁醇/水體系 (3:2:5,v/v/v)時(shí)，K值較大，峰3和4的K值已大于2,分離效果有所改善，但峰仍不能達(dá) 到分離。繼續(xù)減少乙酸乙酯，增大正丁醇的量，采用乙酸乙酯/正丁醇/水體系（2:3:5，v/ v/v)，盡管K值已經(jīng)很大（1.K= 1. 85 ;2.K= 2. 46 ;3.K= 4. 45 ;4.K= 4. 56)，遠(yuǎn)大于 2， 但仍能得到較好的分離效果。由此可認(rèn)為，分離本發(fā)明各化合物選擇溶劑體系時(shí)，除了參考 K值外，實(shí)際的分離試驗(yàn)也很有必要，采用K值較大的溶劑體系，延緩出峰時(shí)間，有利于峰的 分咼。
[0014] HSCCC分離的其他條件如轉(zhuǎn)速、柱溫、流速對(duì)分離也有較大的影響，需進(jìn)行試驗(yàn)選 擇合適的條件。乙酸乙酯/正丁醇/水體系屬于界面張力較高的溶劑系統(tǒng)，較高的轉(zhuǎn)速可 以促進(jìn)分配和減少質(zhì)點(diǎn)的傳遞阻力[14]，故選擇轉(zhuǎn)速為900r/min。儀器柱溫對(duì)固定相的保 留有不可忽視的作用，對(duì)親水性強(qiáng)的正丁醇溶劑體系的固定相保留率有較大影響，升高柱 溫有助于提高該體系的固定相保留率[15]，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)柱溫35°C時(shí)，乙酸乙酯/正丁醇/水 (2:3:5，v/v/v)體系的保留率為46%，達(dá)到分離要求。由于所選溶劑體系保留率較低，高流 速不利于固定相保留，故選擇流速為2.OmL/min。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟（1)中，乙醇濃度為70%v/v。
[0016] 本發(fā)明還提供了從全緣葉綠絨蒿花中同時(shí)分離2種黃酮類(lèi)成分的方法，它包括如 下操作步驟：
[0017] (1)取罌粟科綠絨蒿屬植物全緣葉綠絨蒿M.integrifolia(Maxim. )Franch.的 花，粉碎，以60~70%v/v乙醇為溶劑進(jìn)行提取，收集醇提液，減壓回收乙醇，依次用水一一 乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)和水一一正丁醇溶劑系統(tǒng)萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，除去溶 劑后，所得殘?jiān)礊榇痔嵛铮?br>[0018] (2)取乙酸乙酯：正丁醇：水=2:3:5v/v/v，充分振搖，靜置分層，以上相為固定 相，下相為流動(dòng)相，將固定相充滿分離螺旋管，柱溫30~35°C，主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為890~ 920r/min，然后以2mL/min的流速栗入流動(dòng)相，至兩相溶劑在管柱中達(dá)到平衡狀態(tài)；將步驟 ⑴制備的粗提物，以下相為溶劑溶解，制備樣品溶液，將樣品溶液進(jìn)樣，在254nm下監(jiān)測(cè)， 依次收集出峰時(shí)間為250~280min、300~320min的目標(biāo)成分，即依次得到化合物1~2， 各化合物結(jié)構(gòu)式如下：
[0019]
[0020] 其中，步驟（1)中，乙醇濃度為70%v/v。
[0021] 其中，步驟（2)中，柱溫為35°C。
[0022] 其中，步驟（2)中，轉(zhuǎn)速為900r/min。
[0023] 本發(fā)明還提供了化合物1或2在制備抗氧化的藥物或保健品種的用途。
[0024] 進(jìn)一步地，所述藥品或保健品是清除自由基的藥品或保健品。
[0025] 其中，所述自由基為DPPH自由基。
[0026] 本發(fā)明通過(guò)HSCCC法，從全緣葉綠絨蒿中成功分離純化出了4種黃酮類(lèi)化合物，分 離速度較快，為全緣葉綠絨蒿物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定了基礎(chǔ)。
[0027] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，上述分離的已知化合物或新化合物均具有良好的清除自由基活性， 可將其作為抗氧化的藥物或保健品。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1全緣葉綠絨蒿花粗提物的HSCCC色譜圖
[0029] 圖2不同摩爾濃度化合物、Vc和BHT清除DPPH活性圖
[0030] 圖中標(biāo)記的數(shù)字" 1"、" 2 "、" 3 "、" 4 "，依次表示化合物" 1"、" 2 "、" 3 "、" 4 "。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 實(shí)施例1 4種黃酮類(lèi)成分的制備
[0032] (1)粗提物制備
[0033] 稱(chēng)取全緣葉綠絨蒿花10g，打粉機(jī)粉碎，粉末不大于0.3mm(基本全部通過(guò)3號(hào) 篩），加70%乙醇（v/v) 200mL，超聲（45kHz，300w)提取3次，每次45min，合并3次濾液，減 壓回收乙醇，得濃縮液，將濃縮液置于-80°C冰箱過(guò)夜后，冷凍干燥，得干浸膏3.llg，干浸 膏得率為31. 1%。
[0034] 取浸膏約150mg，用50mL水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃 取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，45°C減壓回收溶劑，所得粗提物備用。
[0035](2)分離純化
[0036] 在分液漏斗中按乙酸乙酯/正丁醇/水（2:3:5,v/v/v)配置兩相溶劑系統(tǒng)共2L， 充分振搖，靜置分層。以上相為固定相，下相為流動(dòng)相，將制備好的樣品浸膏溶于20mL下相 中，備用。
[0037] 以20mL/min的流速將溶劑系統(tǒng)上相栗入主機(jī)充滿分離螺旋管，循環(huán)水浴溫度 35°C，UV檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，轉(zhuǎn)速900r/min，正轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以流速2.OmL/min栗入下相， 待下相從管柱出口流出并且基線穩(wěn)定后，將樣品溶液由進(jìn)樣圈注入，根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集 各色譜峰組分（見(jiàn)圖1)，即可分別得到化合物1~4。
[0038] 其中，收集出峰時(shí)間為250~280min的部位，減壓除去溶劑后，所剩固形物即為化 合物 1 (60mg);