5-羥基吲哚乙酸免疫原、抗體和檢測(cè)試劑及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及5-羥基吲哚乙酸免疫原、抗5-羥基吲哚乙酸特異 性抗體和5-羥基吲哚乙酸檢測(cè)試劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 5_ 羥基吲噪乙酸（5-Hydroxyindole-3_aceticacid，5-HIAA)，其結(jié)構(gòu)式如式 (II)所示：
[0003]
[0004]5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA)作為5-羥色胺（5-HT)的代謝產(chǎn)物，是由單胺氧化酶催 化經(jīng)5-羥基吲哚乙醛轉(zhuǎn)變而來。5-HIAA在肝臟中代謝，并隨尿液排泄至體外。5-HT水平 在中午時(shí)分最高，午夜最低，故其代謝產(chǎn)物5-HIAA的含量白天較夜晚高，因此測(cè)定24h尿液 更能準(zhǔn)確的反應(yīng)5-HIAA的含量水平。臨床上5-HIAA含量升高常見于類癌瘤、熱帶口炎性 腹瀉、支氣管燕麥細(xì)胞癌等疾??；而其含量降低常見于腎病、抑郁癥、強(qiáng)迫性神經(jīng)癥。因此， 測(cè)定尿液中5-HIAA含量可為多種疾病的診斷、治療以及發(fā)病機(jī)制的研究提供重要依據(jù)。 [0005]目前用于5-HIAA含量檢測(cè)的方法主要有：高效液相色譜法、離子色譜法等。但是 這些方法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、檢測(cè)規(guī)模小，并不適用于臨床患者尿液中5-HIAA含量的檢測(cè)。目 前市場(chǎng)上缺乏穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)的5-HIAA檢測(cè)試劑，尤其是質(zhì)量好的自動(dòng)化 檢驗(yàn)試劑。因此，研發(fā)一種質(zhì)量達(dá)到臨床檢驗(yàn)要求、實(shí)用性強(qiáng)、性價(jià)比高，可應(yīng)用于全自動(dòng)生 化分析儀的5-HIAA檢測(cè)試劑勢(shì)在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，采用獨(dú)特的5-羥基吲哚乙酸制備免疫原 性強(qiáng)的5-羥基吲哚乙酸免疫原及其抗體，用該抗體制備的5-羥基吲哚乙酸均相酶免疫檢 測(cè)試劑可以實(shí)現(xiàn)在全自動(dòng)生化分析儀上對(duì)5-羥基吲哚乙酸高通量、快速化的檢測(cè)。該檢測(cè) 試劑具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，還能有效降低5-羥基吲哚乙酸 檢測(cè)成本，有利于臨床推廣使用。
[0007]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種免疫原性強(qiáng)的5-羥基吲哚乙酸免疫原。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種5-羥基吲哚乙酸免疫原的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供使用本發(fā)明5-羥基吲哚乙酸免疫原制備得到的特 異性強(qiáng)的抗5-羥基吲哚乙酸特異性抗體。
[0010] 本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種5-羥基吲哚乙酸檢測(cè)試劑及其制備方法。
[0011] 本發(fā)明的5-羥基吲哚乙酸免疫原，免疫原性高，可以誘導(dǎo)得到高效價(jià)的抗5-羥基 吲哚乙酸特異性抗體。該抗體特異性高，與5-羥基吲哚乙酸的結(jié)合力強(qiáng)。由該抗體制備得 到的5-羥基吲哚乙酸檢測(cè)試劑，可以快速、準(zhǔn)確地確定樣品中的5-羥基吲哚乙酸含量。本 發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0012] 一種5-羥基吲哚乙酸免疫原，其結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：
[0013]
[0014] 載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)或多肽，選自血清蛋白、血藍(lán)蛋白或甲狀腺球蛋白 中的一種。更優(yōu)選為血清白蛋白，進(jìn)一步優(yōu)選為牛血清白蛋白。
[0015] 所述的5-羥基吲哚乙酸免疫原由5-羥基吲哚乙酸與上述載體連接而成，5-羥基 吲哚乙酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)如式（II)所示：
[0016]
[0017] 該5-羥基吲哚乙酸免疫原的制備方法如下：
[0018] (1)將載體蛋白100~300mg溶解于25~75ml0? 2M，pH8. 5的磷酸緩沖液中；
[0019] (2)將如下化學(xué)品加入到小燒杯中攪拌溶解：100~300mg5-羥基吲哚乙酸、 1. 75~5. 25ml二甲基甲酰胺、1. 75~5. 25ml乙醇、3. 5~10. 5ml10mM，pH5. 0的磷酸鉀 緩沖液、100~300mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基）碳二亞胺、25~75mgN-羥基硫代琥 珀酰亞胺，將這些化學(xué)品在室溫下攪拌溶解反應(yīng)30~60min;
[0020] (3)將溶解好的溶液滴加至載體蛋白溶液中，并在2~8°C下攪拌過夜，得到抗原； 將合成好的抗原經(jīng)過透析進(jìn)行純化，得到5-羥基吲哚乙酸免疫原。
[0021] -種抗5-羥基吲哚乙酸特異性抗體，是由上述的5-羥基吲哚乙酸免疫原免疫實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物后產(chǎn)生的完整抗體分子，或者為保留與5-羥基吲哚乙酸特異性結(jié)合能力的抗體片 段或抗體衍生物。
[0022] 所述的完整的抗體分子、抗體片段或抗體衍生物，為采用單一的5-羥基吲哚乙酸 免疫原對(duì)動(dòng)物加強(qiáng)免疫所獲得的多克隆抗體，或者為免疫后經(jīng)體細(xì)胞雜交獲得的單克隆抗 體。所述的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為兔、山羊、小鼠、綿羊、豚鼠或馬的一種，優(yōu)選為兔。
[0023] 所述的抗5-羥基吲哚乙酸特異性抗體由上述制得的5-羥基吲哚乙酸免疫原采用 常規(guī)方法接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，加強(qiáng)免疫后取抗血清。
[0024] 抗5-羥基吲哚乙酸特異性抗體的制備方法，具體步驟如下：
[0025] (1)用PBS將上述合成的BSA-5-羥基吲哚乙酸免疫原稀釋至0? 1~3.Omg/ml，得 到抗原溶液，然后用〇. 5~5. 0ml抗原溶液與等量弗氏完全佐劑混合，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行注 射；
[0026] (2)2~3周后，再用0. 5~5. 0ml相同的抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑對(duì)上述 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射一次，之后每隔四周注射一次，共計(jì)注射3~6次；
[0027] (3)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取血，分離純化得到效價(jià)為1:30000~1:50000的抗5-羥基 吲哚乙酸特異性抗體。
[0028] 本發(fā)明提供一種5-羥基吲哚乙酸檢測(cè)試劑，含有上述的抗5-羥基吲哚乙酸特異 性抗體和指示試劑，所述的指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒光試劑或發(fā)光試劑 中的一種；所述的酶試劑由5-羥基吲哚乙酸酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物組成，酶標(biāo)偶聯(lián)物為葡 萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物，酶的底物為葡萄糖-6-磷酸。
[0029] 5-羥基吲哚乙酸檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于包含以下步驟：
[0030] (1)試劑A:將2. 018~8. 072g、5. 625~22. 50mM氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷 酸和 0? 856 ~3. 422g、5. 625 ~22. 50mM葡萄糖-6-磷酸用 0? 5 ~2L55mM、pH= 8. 0 的 Tris緩沖液溶解制成均相酶底物；將所述的抗5-羥基吲哚乙酸特異性抗體加到上述均相 酶底物中，抗5-羥基吲哚乙酸特異性抗體與均相酶底物的體積比為1:100~1:10000 ;
[0031] (2)試劑B:將5-羥基吲哚乙酸酶標(biāo)偶聯(lián)物加到120mM、pH= 8. 2的Tris緩沖液 中，5-羥基吲哚乙酸酶標(biāo)偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:100~1:10000。
[0032] 所述的抗5-羥基吲哚乙酸特異性抗體與均相酶底物的體積比優(yōu)選為1:800;
[0033] 所述的5-羥基吲哚乙酸酶標(biāo)偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比優(yōu)選為1:2000。
[0034] 所述的5-羥基吲哚乙酸酶標(biāo)偶聯(lián)物的制備方法包含以下步驟：
[0035] (1)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液的制備：稱取7. 5~22. 5mg規(guī)格為100KU的葡 萄糖_6_磷酸脫氫酶，室溫溶解于6~18mL含有72. 6mg0. 05MTris、8mg3. 3mMMgCl# lOOmgNaCl的溶液中，pH= 9. 0 ;在溶液中加入112. 5~337. 5mg還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤 二核苷酸、67. 5~202. 5mg葡萄糖-6-磷酸以及0. 375~1. 125mL卡必醇；再逐滴加入1~ 3mL二甲基亞砜；
[0036] (2) 5-羥基吲哚乙酸的激活：在無水狀態(tài)下稱取5~15mg5-羥基吲哚乙酸，溶解 于300~900yL二甲基甲酰胺中；使上述溶液溫度降到-2~-8°C;加入1. 5~4. 5yL三 丁胺；加入〇. 75~2. 25yL氯甲酸異丁酯；-2~-8°C攪拌30~60分鐘；
[0037] (3)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與5-羥基吲哚乙酸的連接：將步驟（2)激活的5-羥基 吲哚乙酸溶液逐滴加入到步驟（1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液中；2_8°C攪拌過夜；
[0038] (4)純化產(chǎn)物：通過G-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，于2-8°C下儲(chǔ)存。
[0039] 5-羥基吲哚乙酸均相酶免疫檢測(cè)試劑在使用之前，為了避免指示試劑中的酶標(biāo)偶 聯(lián)物和酶的底物發(fā)生反應(yīng)，酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物是不混合的且分開放置，所以將酶的底 物與