嗜硒微生物Wautersiella enshiensis YLX-1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種嗜硒微生物及其應(yīng)用，尤其涉及一種嗜硒微生物Wautersiella enshiensisYLX-1及其在微生物轉(zhuǎn)化合成有機(jī)硒、微生物合成納米硒、微生物活化硒礦石、 富硒微生物肥料制備及硒污染環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 極端微生物是指適合在極端環(huán)境中生活的微生物種屬，包括嗜熱菌、嗜鹽菌、嗜 堿菌、嗜酸菌、嗜壓菌、嗜冷菌以及抗輻射、耐干燥、抗高濃度金屬離子和極端厭氧的微生 物（Rothschild&Mancinelli，2001;陳駿等，2006)，目前極端微生物的研究主要在大洋中 脊、熱泉、鹽湖、礦坑排水等區(qū)域。在深海洋中脊的熱液環(huán)境中生活著大量嗜熱、嗜壓細(xì) 菌，其在洋中脊的Fe、S、Zn、Cu循環(huán)及成礦中扮演著重要的角色（Taylor&Wirsen, 1997 ; Labrenzetal. , 2000 ；Kasama&Murakami, 2001 ；Emerson&Mayer, 2002；Kennedyet al.，2003;彭曉彤等，2007;陳順等，2010)。地質(zhì)微生物學(xué)家對美國黃石公園（Susanet al.，1994, 1996)、冰島（Marteinssonetal.，2001;Thomasetal.，2007)、意大利（Kvist etal.，2005)、中國云南（宋兆齊等，2008;黃秋媛等，2010)等地的眾多熱泉進(jìn)行研究， 揭示在這些高達(dá)70攝氏度以上，有些甚至超過100攝氏度的熱泉里面，活躍著大量嗜熱 微生物一一泉古菌，拓展了我們之前對微生物生存極限的想象。而美國猶他大鹽湖（鹽 度2. 2% )、死海（鹽度2. 5% )、里海（鹽度（1. 7% )等高鹽環(huán)境中生活著許多抗高滲透 壓微生物（Antonioetal.，1998;Vreelandetal.，1998 ;0renetal.，2001)。位于青 海省東北部的中國境內(nèi)最大的內(nèi)陸高原咸水湖泊，更由于其獨特的沉積環(huán)境，成為地質(zhì)微 生物學(xué)研究的天然實驗室（妥進(jìn)才等，2005)。酸性礦坑排水中大量存在嗜酸鐵氧化菌， 如氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillusferrooxidans)，大量參與Fe、Mn、S等的循環(huán) (Baker&Banfield, 2003 ;Fortin&Langley, 2005 ;陸建軍等，2005 ;蔣嘉等，2006)，一方面造 成廣泛的生態(tài)問題，另一方面為礦坑排水的治理提供了新的思路（Johnson&Kevin, 2003)。 即使對于遙遠(yuǎn)南極的厚厚冰層下封存幾百萬年之久的冰下湖生命系統(tǒng)，我們依然保存著濃 厚的興趣（Bulatetal.，2009, 2011)。
[0003] 可是，很少有人關(guān)注富硒極端環(huán)境中的微生物組成。這主要是因為硒是地殼中的 微量元素，難以成礦或形成極端富硒的環(huán)境，極大限制了對嗜硒微生物的研究。
[0004] 湖北恩施漁塘壩具有世界上唯一的硒礦床，是典型和獨特的極端富硒環(huán)境，在硒 礦區(qū)的滲濾水系統(tǒng)和硒礦尾礦的滲濾水系統(tǒng)中具有高濃度的硒含量，其中水體中的硒含量 高達(dá)40.0-94.1 1^/1，平均值為58.4±16.8 1^/1(21111&21161^，2001;211116七&1.，2008)，是 克山病區(qū)水體硒含量的330倍（Fordyceetal.，2000)，是世界衛(wèi)生組織（WHO)推薦飲用水 硒含量上限的10倍（Presser，1994);沉積物中的硒含量高達(dá)8. 28-82. 9mg/kgDW，平均值 為26.6±26.8mg/kgDW(Zhu&Zheng，2001;Zhuetal.，2008)，是美國西部沉積物硒含量上 限值（1. 4mg/kgDW)的19倍（Presser，1994)。目前，僅有朱建明小組對湖北恩施漁塘壩高 硒碳質(zhì)泥巖中的微生物多樣性特征進(jìn)行了初步研究（雷磊等，2009)，并分離了兩株具有亞 硒酸鹽還原能力的細(xì)菌（王明義等，2006)。在發(fā)明專利方面，僅有《一種利用微生物發(fā)酵生 產(chǎn)活化硒礦粉的方法》（ZL201210166664. 4)和《一種利用超耐硒微生物制備紅色單質(zhì)硒的 方法》（申請?zhí)?01210167650. 6)中利用湖北恩施硒礦物的硒礦渣、土壤進(jìn)行分離相關(guān)耐硒 微生物，進(jìn)而接種到硒礦粉或其他含硒介質(zhì)中，制備活化硒礦粉或紅色單質(zhì)硒。但發(fā)明專利 中并未分離純化相關(guān)耐硒微生物，也未鑒定微生物種屬和特征。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種嗜硒微生物Wautersiellaenshiensis YLX-1及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供了一種嗜硒微生物WautersiellaenshiensisYLX-1，該嗜硒微生物 是從中國湖北恩施硒礦區(qū)滲濾水系統(tǒng)的菌席沉積物中分離純化的、具有嗜硒微生物特征的 細(xì)菌新種，該嗜硒微生物的保藏名稱為沃氏菌YLX-1(WautersiellaenshiensisYLX-1)， 保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏地址為：中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期 為2013年12月18日，保藏編號為CCTCCN0:M2013671。
[0008] 該嗜硒微生物的菌種菌學(xué)特征描述如下：
[0009] 【形態(tài)特征】該嗜硒微生物在28攝氏度的TSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時觀察到的菌 落為黃色平滑的圓形，并具有全緣凸面（附圖1);對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯示為革蘭氏 陰性菌。透射電子顯微鏡下觀察到的菌株為棒狀、非孢子形成，大小為0. 4~0. 7X0. 8~ 2.0_(附圖2);
[0010]【嗜硒特征】將本發(fā)明所述菌種依次分別接入到含硒（以亞硒酸鈉配置）〇、1〇、 100、500、1000、3000、6000mg/L的TSB培養(yǎng)液中，結(jié)果顯示：在硒濃度彡10mg/L情況下，細(xì) 菌生長不受抑制（附圖3)，培養(yǎng)液顏色不呈現(xiàn)明顯的紅色（附圖5)。在硒濃度多100mg/L 情況下，菌種在l〇〇mg/L含硒培養(yǎng)液中生長最快，500mg/L次之，但1000mg/L、3000mg/L和 6000mg/L中生長依次明顯減慢（附圖4)，必須指出的是即使在硒含量高達(dá)6000mg/L的極 端條件下，菌種依然能生長，體現(xiàn)出了極端耐硒能力。而且在硒濃度高于l〇〇mg/L條件下， 培養(yǎng)液顏色明顯呈現(xiàn)紅色，那是因為細(xì)菌開始將亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化為紅色單質(zhì)硒（附圖5)。
[0011] 【16SrRNA基因序列分析】從本發(fā)明所述菌株的純培養(yǎng)物中提取基因組DNA，利用 通用引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，進(jìn)一步通過CLUSTALX軟件和Mega4. 0軟件 以Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（附圖6)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示菌株 屬于沃氏菌屬（Wautersiella)，但與其親緣關(guān)系最近的WautersiellafalseniiNF993t 的序列相似性只有96. 7%，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，確定為沃氏菌新種，命名為Wautersiella enshiensisYLX-1，于2013年12月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏地 址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號：CCTCCNo:M2013671。
[0012] 【生理生化反應(yīng)特征】本發(fā)明所述菌株的API20NE(非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定 系統(tǒng)）反應(yīng)顯示，菌株能很好地同化葡萄糖、麥芽糖、蘋果酸、檸檬酸鈉，也能很好地水解七 葉靈檸檬酸鐵、明膠，還能與脲素和對硝基-D-甲基半乳糖進(jìn)行反應(yīng)（表1)。該菌株的API ZYM(酶的活性）檢測顯示，菌株的堿性磷酸鹽酶、酯酶（C4)、類脂酯酶（Cs)、白（亮）氨酸 芳氨酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、a-葡萄糖苷酶、0 -葡萄糖苷酶 均具有較強(qiáng)的活性，纈氨酸芳胺酶具有弱活性（表2)。該菌株的生長溫度為4-37°C(最適 溫度為20°C)、pH為5. 0-9.0 (最適pH為7)、鹽度為0-5% (大于5%不生長），該菌株為 兼性厭氧菌，無運動特性，可水解Tween40 (表3)。菌株的DNAG+C摩爾比例為31.6%，主 要呼吸醌為MK-6,主要脂肪酸為C16:1? 6c、C16:1? 7c、is〇-C15:。、is〇-C17:Q30H、C16:。、C16:1? 5c、 is〇-C17:1I/anteis〇-C17:1B(表 4) 〇
[0013] 表1菌株API20NE(非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)）反應(yīng)
[0014]
[0016] 注：" "表示陽性，"一 "表示陰性。
[0017] 表2菌株APIZYM(酶的活性）檢測
[0018]
[0019] 注:" 表示陽性，" "表示陰性，"w"表示弱陽性。 '
[0020] 表3菌株生理生化指標(biāo)
[0021]
[0022] 表4菌株脂肪酸組成特征 '
'
[0023]
[0024]
[0025] 注：1 :"tr" 表示"含量〈1 %" ；2:"SummedFeature2" 包含"C14:(]-30H、 is〇-C16:1-I'，；3:"Summedfeature3"包含"C16:l?7c、C16:l?6c'，;4:"Summedfeature 4"包含"iso_C17:1I、anteiso_C17:1B"；5:"Summedfeature9"包含"iso_C17:1c〇9c、C16:。 10-methyl'，。
[0026] 本發(fā)明還公開了嗜硒微生