培養(yǎng)獲得組織工程表皮的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)獲得組織工程表皮的方法，尤其涉及一種黑色素細胞和角質(zhì)細胞共培養(yǎng)的表皮形成的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]組織工程皮膚在醫(yī)療和美容界隨著這項技術(shù)的成熟有著越來越廣泛的應(yīng)用，并且在安全、廣泛性治療效果等方面遠遠優(yōu)于其他治療手段?，F(xiàn)在在皮膚組織疾病的治療上除了藥物治療外大都實施兩種治療方法:自體皮膚的直接移植和異體皮膚或皮膚替代物的移植；自體移植物無法一次性完成大面積部位的治療，需要重復(fù)手術(shù)。
[0003]在可以大面積治療的產(chǎn)品中，常將自體或異體的表皮細胞提取并培養(yǎng)研究進而獲得產(chǎn)品，現(xiàn)在出現(xiàn)將提取出的表皮細胞與成纖維細胞等細胞接種至生物材料中做皮膚替代物的專利，如2003年呂偉光、韓斌等人申請的有關(guān)專利(申請?zhí)枮?3150373.X)為組織工程自體符合皮膚及其制備方法，該發(fā)明是將來源于患者自體的表皮干細胞和真皮成纖維細胞在體外擴增和分化，再將表皮細胞種植于含有患者自體真皮成纖維的纖維蛋白生物支架上進行培養(yǎng)，在體外結(jié)構(gòu)組織工程自體復(fù)合皮膚。這種組織工程復(fù)合皮膚有來源于自體細胞，無排斥反應(yīng)，且因支架的存在而具有一定的強度與韌性，但尚存在一些缺陷:一、角質(zhì)細胞與成纖維細胞共同培養(yǎng)時有競爭關(guān)系，因而幾種細胞在生物支架上共同生長時的生長狀態(tài)可能存在一種細胞對另一種細胞的抑制，無法保證全部種類細胞的良好生長；二、纖維蛋白支架直接與移植面接觸，相比自然生長的全層皮膚存在一定粘連性等接觸問題；三、移植之后環(huán)境的變化能否讓支架上的細胞很好存活并各種代謝活動正常仍不清楚。
[0004]而對于其他的異體皮膚組織工程產(chǎn)品來說，仍存在與自然皮膚的結(jié)構(gòu)不同，異體來源的皮膚細胞的排斥、細胞在生物支架上的存活、生長狀態(tài)和細胞基質(zhì)的分泌會存在差異，生物支架與移植面的快速融合等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述問題，本發(fā)明提供了一種體外培養(yǎng)獲得組織工程表皮的方法及其應(yīng)用，表皮細胞與黑色素細胞共培養(yǎng)，并可獲得具有基底層、有棘層、顆粒層、角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的表皮膜片，具有面積大、無排異反應(yīng)、結(jié)構(gòu)與自然表皮極為相似、治療效果好等特點。
[0006]本發(fā)明第一個方面是提供一種培養(yǎng)獲得組織工程表皮的方法，包括:將表皮角質(zhì)細胞與黑色素細胞共培養(yǎng)，獲得組織工程表皮。
[0007]其中，所述共培養(yǎng)優(yōu)選為無血清、無滋養(yǎng)層的共培養(yǎng)方法。
[0008]其中，所述表皮角質(zhì)細胞與黑色素細胞優(yōu)選為第一次傳代細胞。
[0009]其中，表皮角質(zhì)細胞與黑色素細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分包括:DMEi^P F12按照3: (0.5-2)體積比例的混合液，并且，所述混合培養(yǎng)基組分還含有KSR5-20wt%，優(yōu)選為6-16wt%,更優(yōu)選為 8_15wt%，更優(yōu)選為 10_14wt%。
[0010]其中，DMEM和F12體積比例優(yōu)選為3: (1-1.5)。
[0011]更優(yōu)選地，所述混合培養(yǎng)基還可以含有如下任意一種或幾種組分:
[0012]胰島素2-8mg/L，優(yōu)選為3_6mg/L，更優(yōu)選為4_5mg/L ；
[0013]轉(zhuǎn)鐵蛋白2-10mg/L，優(yōu)選為3_8mg/L，更優(yōu)選為5_6mg/L ；
[0014]氫化可的松0.1-lmg/L，優(yōu)選為 0.2-0.8mg/L，更優(yōu)選為 0.4-0.6mg/L ；
[0015]表皮生長因子2-15u/L，優(yōu)選為5-12u/L，更優(yōu)選為8-lOu/L ；
[0016]三碘甲狀腺原氨酸l_2u/L，優(yōu)選為1.2-1.8u/L，更優(yōu)選為1.4-1.6u/L。
[0017]其中，表皮角質(zhì)細胞與黑色素細胞數(shù)量比例優(yōu)選為100: (0.001-80)，優(yōu)選為100: (0.01-60)，優(yōu)選為 100: (0.1-50)，優(yōu)選為 100: (0.5-40)，優(yōu)選為 100: (1-30)，優(yōu)選為100: (5-20)，優(yōu)選為 100: (10-15)。
[0018]其中，所述表皮角質(zhì)細胞與黑色素細胞可以是源于同一生物體或不同生物體，也可以是源于同一生物體的不同部位或相同部位。
[0019]在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述表皮角質(zhì)細胞和黑色素細胞的獲得方法優(yōu)選為:將保留表皮層以及至少部分真皮層的活性皮膚樣本破碎，經(jīng)過胰酶消化液冷消化后，收集沉淀組織；
[0020]將收集的沉淀組織通過I型膠原酶進行熱消化，收集表皮細胞作為原代細胞接種。
[0021 ] 本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述皮膚樣本可以是異體和/或自體皮膚樣本，并優(yōu)選為自體皮膚樣本。
[0022]所述皮膚樣本可以是源自胸部、腹部、背部、臀部、四肢等任意一種或幾種部位的皮膚。
[0023]本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述活性皮膚樣本中，真皮層占初始皮膚樣本中真皮層的體積比，優(yōu)選為15-50 %，更優(yōu)選為20-45 %，更優(yōu)選為25-40 %，更優(yōu)選為30-35 %。
[0024]在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實施例中，所述培養(yǎng)方法包括:
[0025]原代細胞接種后進行傳代，直至細胞匯合；
[0026]細胞匯合后在混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)生成具有基底層、有棘層、顆粒層、角質(zhì)層結(jié)構(gòu)并且黑色素細胞分布在基底層中的組織工程表皮皮片。
[0027]本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述胰酶消化液優(yōu)選為包括trypsin/EDTA與DPBS的混合液物，其中trypsin/EDTA與DPBS體積比優(yōu)選為1: (2-5)，更優(yōu)選為1: (2.5-4.5)，更優(yōu)選為1:(3-4)ο
[0028]其中，所述胰酶消化液濃度優(yōu)選為0.01-0.5wt%，更優(yōu)選為0.03-0.25wt%，更優(yōu)選為 0.05-0.1wt % ο
[0029]其中，trypsin/EDTA濃度優(yōu)選為0.1-1wt %，更優(yōu)選為0.2-0.6wt %，更優(yōu)選為0.25-0.5wt % ο
[0030]其中，所述胰酶消化液冷消化的條件優(yōu)選為2-8 V，更優(yōu)選為3-6 V，更優(yōu)選為4-5 cC ο
[0031 ] 其中，所述胰酶消化液冷消化的時間優(yōu)選為8-24小時，更優(yōu)選為10-20小時，更優(yōu)選為12-18小時，更優(yōu)選為14-16小時。
[0032]本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述I型膠原酶濃度優(yōu)選為0.05-0.5wt%。
[0033]其中，所述I型膠原酶進行熱消化的條件優(yōu)選為36-37.5°C，優(yōu)選為36.5-37°C。
[0034]發(fā)明上述內(nèi)容中，所述傳代方法優(yōu)選為:在y27632存在下，36-37.5°C (優(yōu)選為36.5-370C )、⑶2(優(yōu)選為2-8%體積比例，如5_6% )存在下培養(yǎng)，用含EDTA的緩沖液清洗表皮細胞，然后繼續(xù)胰酶消化，添加酶抑制劑，收集細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞匯合。
[0035]更優(yōu)選地，接種后的原代細胞用Y-276322HC1處理，清洗后再進行胰酶消化，其中所述胰酶優(yōu)選為含有Y-276322HC1，濃度優(yōu)選為0.01-0.1wt %，更優(yōu)選為0.02-0.08wt %，更優(yōu)選為0.04-0.07wt %，更優(yōu)選為0.05-0.06wt %。其中，所述清洗優(yōu)選為使用EDTA/PBS緩沖液清洗，EDTA/PBS緩沖液濃度優(yōu)選為0.001-0.005wt%,更優(yōu)選為0.002-0.004wt%。
[0036]發(fā)明上述內(nèi)容中，所述原代細胞接種所用培養(yǎng)基優(yōu)選為角化細胞培養(yǎng)基，如KGM-Gold培養(yǎng)基。更優(yōu)選為所述接種后3-6天時進行傳代。
[0037]本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述組織工程表皮的培養(yǎng)方法還包括將生成的皮片從培養(yǎng)容器中分離的步驟。
[0038]其中，所述分離的步驟包括:用分散酶消化生成的表皮皮片，然后將油紗布覆蓋在皮片上，使皮片依附油紗布，從而將皮片從培養(yǎng)容器中分離。
[0039]本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述組織工程表皮的培養(yǎng)方法還包括對所述表皮皮片的后處理的步驟。
[0040]其中，所述后處理的步驟包括:清洗表皮皮片后，用培養(yǎng)基潤濕。其中所述培養(yǎng)基優(yōu)選為PBS培養(yǎng)基。其中優(yōu)選地，用PBS清洗所述表皮皮片。
[0041]其中，用培養(yǎng)基潤濕后的可以冷凍儲存、或不冷凍儲存直接進行合格檢查、或直接應(yīng)用。
[0042]本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述組織工程表皮的培養(yǎng)方法還包括對所述表皮皮片進行合格檢查的步驟。
[0043]其中，所述合格檢查優(yōu)選為包括如下檢查項目中的任意一種或幾種:多巴染色和蘇木素染色，觀察黑色素細胞在基底層中的分布；切片檢查皮片的縱向結(jié)構(gòu)。
[0044]本發(fā)明第二個方面是提供一種上述任意方法制備的組織工程表皮，按照順序，所述組織工程表皮具有基底層、有棘層、顆粒層、角質(zhì)層結(jié)構(gòu)，并且黑色素細胞分布在所述組織工程表皮的基底層中。
[0045]其中，所述黑色素細胞中全部或至少部分為樹枝狀結(jié)構(gòu)，優(yōu)選為至少60%為樹枝狀結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選為至少80%為樹枝狀結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選為至少95%為樹枝狀結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選為至少99%為樹枝狀結(jié)構(gòu)。
[0046]其中，所述黑色素細胞優(yōu)選為均勻分布。
[0047]其中，所述組織工作表皮優(yōu)選為至少包括4個細胞層結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選為包括4-10個細胞層結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選為4-8個細胞層結(jié)構(gòu)。
[0048]本發(fā)明第三個方面是提供一種所述組織工程表皮的應(yīng)用。
[0049]所述應(yīng)用包括制備皮膚修復(fù)材料中的應(yīng)用，如用于疤痕修復(fù)、妊娠紋的去除、皮膚損傷治療、以及治療皮膚疾病中的任意一種或幾種的皮膚修復(fù)材料。
[0050]其中，所述皮膚疾病包括:色素變化及斑痣類、真菌感染類、病毒感染類皮膚疾病，諸如白癜風(fēng)、雀斑、白化病、花斑癬、黃褐斑、紫癜、色素痣、太田痣、熱激紅斑、手癬、足癬、體癬、皰疹、疣等。
[0051 ] 其中，皮膚損傷包括手術(shù)創(chuàng)面、曬傷、燒傷、凍傷、擦傷、割傷、潰瘍、外傷導(dǎo)致的真皮萎縮中的任意一種或幾種。所述手術(shù)創(chuàng)面如腫瘤、胎記等切除后的創(chuàng)面。所述潰瘍可以包括代謝性疾病如糖尿病足潰瘍、放療和/或化療后皮膚慢性潰瘍、壓力性潰瘍、靜脈潰瘍等慢性潰瘍。
[0052]其中，所述皮膚修復(fù)材料用于植入創(chuàng)面，替代或覆蓋病損皮膚。
[0053]所述應(yīng)用包括制備用