一種基于初次卵裂時(shí)間和囊胚基因表達(dá)水平篩選檢測山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于初次卵裂時(shí)間和囊胚基因表達(dá) 水平篩選檢測山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 克隆（體細(xì)胞核移植）技術(shù)能將體細(xì)胞在體外去分化，發(fā)育成具有全能性的胚胎， 這在臨床上有巨大的應(yīng)用前景。然而，SCNT技術(shù)過程復(fù)雜、影響因素多，通過SCNT技術(shù)獲 得出生個(gè)體的效率也非常低，嚴(yán)重制約轉(zhuǎn)基因大家畜的研究與應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏有效的 胚胎評估體系，不能篩選出優(yōu)質(zhì)的移植胚胎是影響SCNT效率低下的主要原因之一。因此， 尋找一種更為客觀、全面的評估胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能的方法，篩選優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植至關(guān) 重要。
[0003]當(dāng)前胚胎的評估手段主要是直觀的形態(tài)學(xué)觀察，依據(jù)胚胎卵裂球數(shù)目、碎片程度 及均等性可以評估胚胎質(zhì)量。雖然形態(tài)學(xué)方法無創(chuàng)、方便、快速，但缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，并且不能 準(zhǔn)確反映胚胎的功能狀態(tài)，觀察者間的主觀性使卵子與胚胎發(fā)育的關(guān)聯(lián)顯示出差異性。另 外，形態(tài)正常的胚胎也可能存在遺傳或表觀遺傳缺陷。前期有研究表明：胚胎培養(yǎng)過程中， 早期卵裂胚胎相對于晚期卵裂的胚胎更容易發(fā)育到囊胚階段。Edward等研究發(fā)現(xiàn)受精卵卵 裂時(shí)間與懷孕率有關(guān)，Van Montfoort等發(fā)現(xiàn)，早卵裂胚胎的懷孕率（46% )高于晚卵裂胚 胎（18% )，早卵裂胚胎組的流產(chǎn)率（20% )低于晚卵裂胚胎的流產(chǎn)率（48% )。此外，牛的 早期卵裂胚胎發(fā)育到囊胚的幾率明顯高于晚期卵裂胚胎，并且囊胚細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞凋亡 數(shù)較低的比例。研究表明，初次卵裂時(shí)間可以作為豬克隆胚胎發(fā)育潛能的重要標(biāo)識，選擇早 裂的胚胎進(jìn)行移植，有助于提高克隆效率。山羊作為重要的家畜，不僅可以為市場提供豐富 的肉、毛、絨、皮和乳等畜產(chǎn)品，而且具有重要的科研價(jià)值。然而，關(guān)于山羊克隆胚胎卵裂時(shí) 間和發(fā)育潛能的研究較少，因此，本試驗(yàn)初步探索不同初次卵裂時(shí)間對后續(xù)山羊克隆胚胎 發(fā)育能力的影響。
[0004]盡管胚胎的初次卵裂時(shí)間是衡量胚胎質(zhì)量和后續(xù)發(fā)育能力的重要指標(biāo)之一，然而 具體的內(nèi)在基因變化尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)早期卵裂胚胎多數(shù)來自于胞漿和核同步性較好的 優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞，較好的代謝儲備，使得它們能較早的有絲分裂。有研究認(rèn)為，排出第一極體 時(shí)間較早的卵母細(xì)胞，孤雌激活后發(fā)育到囊胚的比例高，進(jìn)一步說明初次卵裂時(shí)間不僅與 胚胎后期發(fā)育潛能有關(guān)而且與卵母細(xì)胞質(zhì)量有很大關(guān)系。以上結(jié)論驗(yàn)證了初次卵裂是由積 累的母源胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄物來調(diào)控的觀點(diǎn)。然而，在受精后胚胎基因組會發(fā)生激活，進(jìn)而引發(fā) 了胚胎核內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活，胚胎后續(xù)的發(fā)育便開始依賴于新合成的mRNA和蛋白質(zhì)。此外，在胚 胎重構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞質(zhì)量會影響重構(gòu)胚的后續(xù)發(fā)育能力，優(yōu)化卵母細(xì)胞體外成 熟的條件能夠提高所構(gòu)建的重構(gòu)胚胎的質(zhì)量。優(yōu)化卵母細(xì)胞體外成熟的條件以及篩選檢測 山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因的方法為現(xiàn)有技術(shù)亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高山羊卵母細(xì)胞的成熟率的方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于初次卵裂時(shí)間和囊胚基因表達(dá)水平篩選檢 測山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種提高山羊卵母細(xì)胞的成熟率的方法，處理卵巢組織并挑選卵母細(xì)胞，在體外 成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)18~30h，所述的體外成熟培養(yǎng)液中添加有1~10 yg/mL 的促卵泡素FSH和1~10 yg/mL促黃體生成素LH。
[0009] 作為一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述體外成熟培養(yǎng)液中添加有10 y g/mL的FSH和10 y g/ mL LH〇
[0010] 所述的體外成熟培養(yǎng)液中還添加有1 yg/mL17 -E2。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述體外成熟培養(yǎng)液的配方為：
[0012] 1 ~10 y g/mL FSH+1 ~10 y g/mL LH+1 y g/mL 17 0 -E2+10 % 胎牛血清的 TCM 199 ；
[0013]最優(yōu)選為：10 y g/mL FSH+10 y g/mL LH+1 y g/mL 17 0 -E2+10 % 胎牛血清的 TCM199 ；
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述體外成熟培養(yǎng)的時(shí)間為24h。
[0015] 所述卵巢組織的處理方法為切剖法或抽吸法。
[0016] -種基于初次卵裂時(shí)間和囊胚基因表達(dá)水平篩選檢測山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān) 基因的方法，包括以下步驟：
[0017] (1)采用供體細(xì)胞和來源于山羊卵巢組織的卵母細(xì)胞構(gòu)建重組胚并激活后卵裂、 發(fā)育至囊胚，并于第24h和48h檢查卵裂率，收集0~24h和24~48h內(nèi)卵裂的胚胎分別 作為早卵裂胚胎組和晚卵裂胚胎組繼續(xù)培養(yǎng)；第7. 5d收集各組囊胚；所述的卵母細(xì)胞為采 用上述的方法進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞；
[0018] (2)提取步驟⑴中所收集的兩組囊胚的RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;
[0019] (3)以步驟⑵合成的cDNA為模板以下序列為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增目的基 因GAPDH、PGC-1 a、NRF-1、BCL2和BAX :
[0020] 擴(kuò)增GAPDH引物對：F:CGACTTCAACAGCGACACTCAC
[0021] R:CCCTGTTGCTGTAGCCGAATTC
[0022] 擴(kuò)增 PGC-1 a 引物對：F: CACCCACAACTCCTCCTCAT
[0023] R:CCTTCCTTTCCTCGTGTC
[0024]擴(kuò)增NRF-1引物對：F:AGGCTGGGGCAAAGAAAG
[0025] R:CCAACCTGGATAAGCGAGAC
[0026]擴(kuò)增BCL2引物對：F:ATGTGTGTGGAGAGCGTCA
[0027] R:AGAGACAGCCAGGAGAAATC
[0028]擴(kuò)增BAX引物對：F:GCATCCACCAAGAAGCTGAG
[0029]R:CCGCCACTCGGAAAAAGAC;
[0030](4)用SPSS 18. 0軟件中的單因素方差分析兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性，兩組實(shí) 驗(yàn)結(jié)果中差異顯著的目的基因即為評估山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因。
[0031] 步驟⑷所述的評估山羊克隆胚胎質(zhì)量的相關(guān)基因?yàn)榫€粒體相關(guān)基因PGC-1 a和 NRF-l〇
[0032] 步驟⑵中提取所述RNA的過程為：將胚胎轉(zhuǎn)移至收集管內(nèi)，向管內(nèi)加入裂解液， 并向裂解液中添加carrier RNA，渦旋后加入70%的酒精，充分混勻，將混合液轉(zhuǎn)移到收集 管和柱子上，離心棄液體，再加入Buffer RW1，離心棄液體；加入DNase I工作液到柱子膜 上，靜置10~20min，加入Buffer RW1，離心后丟棄液體和收集管，加入Buffer RPE，離心棄 液體；然后加入80 %酒精，離心棄液體和收集管后，把柱子放在新的收集管上，打開蓋子全 速離心5min，將柱子放在新的收集管上，垂直加入RNase-free水到柱子膜上，全速離心獲 取 RNA〇
[0033] 研究發(fā)現(xiàn)在胚胎重構(gòu)中，卵母細(xì)胞質(zhì)量會影響重構(gòu)胚的后續(xù)發(fā)育能力，因此，本發(fā) 明首先通過比較卵母細(xì)胞不同采集方法、培養(yǎng)液成分及體外培養(yǎng)時(shí)間等，優(yōu)化了卵母細(xì)胞 體外成熟的條件，然后進(jìn)一步構(gòu)建重構(gòu)胚胎，探討不同初次卵裂時(shí)間的山羊克隆胚胎發(fā)育 至囊胚的潛能及基因的表達(dá)水平變化情況，嘗試從基因的角度探討山羊克隆胚胎初次卵裂 時(shí)間與其發(fā)育潛能的關(guān)系，為提高山羊克隆的效率提供理論參考。
[0034] 轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要是從mRNA水平研究基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而mRNA的表達(dá)水平能反應(yīng)細(xì) 胞的表型和功能。在胚胎發(fā)育過程中，線粒體不僅為胚胎發(fā)育提供能量，還能調(diào)節(jié)胚胎生存 的微環(huán)境，表明線粒體對胚胎的發(fā)育有重要作用，本試驗(yàn)想進(jìn)一步在胚胎水平上研究線粒 體相關(guān)基因與胚胎發(fā)育潛能是否存在相關(guān)性。
[0035] 綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)合胚胎的初次卵裂時(shí)間和卵裂時(shí)胚胎的狀態(tài)，試圖分析線粒 體相關(guān)基因PGC-1 a和NFR-1與胚胎發(fā)育潛能是否存在相關(guān)性，為尋找預(yù)測山羊轉(zhuǎn)基因克 隆胚胎發(fā)育潛能的研究提供了參考，也有助于篩選出優(yōu)質(zhì)的移植胚胎和提高轉(zhuǎn)基因克隆的 效率。
[0036] 本發(fā)明的有益效果：
[0037] 本發(fā)明優(yōu)化了卵母細(xì)胞體外成熟的條件，然后進(jìn)一步構(gòu)建重構(gòu)胚胎，探討不同初 次卵裂時(shí)間的山羊克隆胚胎發(fā)育至囊胚的潛能及基因的表達(dá)水平變化情況，嘗試從基因的 角度探討山羊克隆胚