茶樹低溫脅迫下miRNA熒光定量PCR內(nèi)參基因及其篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種茶樹低溫脅迫下miRNA熒光定量PCR 內(nèi)參基因及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶樹（Camelliasinensis)原產(chǎn)于我國熱帶及亞熱帶，是一種喜溫畏寒的多年生 經(jīng)濟(jì)作物。隨著茶產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，茶樹種植區(qū)域向北擴(kuò)展到北煒38°，我國大部分茶區(qū)， 特別是高山茶園，常遭遇到越冬期低溫凍害或春季"倒春寒"。寒凍害已成為我國茶葉優(yōu)質(zhì) 高產(chǎn)栽培生產(chǎn)中一個(gè)較為突出、亟待解決的問題。長期以來，茶園抗寒一般都是采用優(yōu)化栽 培措施、改善栽培條件來提高茶樹的耐寒性，但是品種的抗寒遺傳特性才是起決定作用的 因素。因此，研究茶樹對寒凍害的抗逆機(jī)制，解析其響應(yīng)低溫的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有針對 性地發(fā)掘相關(guān)抗性基因并加以利用，對開展茶樹分子育種工作有著積極意義。
[0003] 基因表達(dá)分析在生物學(xué)研究中已成為一個(gè)揭示基因水平和生長機(jī)制的重要方法。 實(shí)時(shí)焚光定量PCR(thereal-timefluorescencequantitativePCR，qRT_PCR)與傳統(tǒng)PCR 相比，由于具有重復(fù)性好，特異性強(qiáng)和靈敏度高及高通量等特點(diǎn)，已經(jīng)成為一種快速且可靠 的基因轉(zhuǎn)錄水平的定量方法。然而，有效的qRT-PCR卻取決于很多因素，如提取的RNA的質(zhì) 量、反轉(zhuǎn)錄的效率、引物特異性以及數(shù)據(jù)處理方法等，而采用穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因來控制實(shí) 驗(yàn)誤差也是必要的。
[0004] 在qRT-PCR中，最常用的植物內(nèi)參基因有甘油醛三磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)、肌動蛋白基因（0 -actin，ACT)、 翻譯延伸因子（translationelongationfactor,TEF)、0-微管蛋白（0-tubulin,TUB)、 18S核糖體RNA基因（18SribosomalRNAprotein, 18SrRNA)以及 25S核糖體RNA基因 (25SribosomalRNAprotein, 25SrRNA)等。在用qRT-PCR分析基因的相對表達(dá)時(shí)，研究 者們發(fā)現(xiàn)不經(jīng)篩選直接使用常見內(nèi)參基因，會降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如U6是研究miRNA 相對表達(dá)量最常用的一個(gè)內(nèi)參基因，已有報(bào)道表明U6在人正常和癌變組織中的表達(dá)是不 穩(wěn)定的，其結(jié)果所導(dǎo)致的差異近62倍，不可作為該研究的內(nèi)參基因。Szabo等人認(rèn)為在所有 樣本中都無差異表達(dá)的內(nèi)參基因是不存在的，作為常用內(nèi)參基因的持家基因的表達(dá)也不是 一直穩(wěn)定不變的。為了找到適合的內(nèi)參基因，一般實(shí)驗(yàn)前要對多個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性 進(jìn)行評估。在紫花苜蓿不同組織中，5個(gè)候選內(nèi)參基因（18SrRNA、f3-actin、EF-la、UBC2、 TUB)中屬18SrRNA和EF-1a的表達(dá)最穩(wěn)定；在蘋果著色不同時(shí)間點(diǎn)的果皮中，4個(gè)常用候 選持家基因（0 -actin、EF-1a、GAPDH、18SrRNA)中屬EF-1a和18SrRNA是比較理想的 內(nèi)參基因；多年生黑麥草在非生物脅迫下，6個(gè)候選內(nèi)參基因（eIF4A、TBP-l、E2、UBQ、ZTL、 GAPDH)中，eIF4A和UBQ可作為不同脅迫下的內(nèi)參基因；在茶樹的94個(gè)不同樣品中檢測 11個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，3個(gè)常被使用的持家基因（CsTUBULINl，CsACINTl、Csl8S rRNAl)是最不穩(wěn)定的，而CsPTBl,CsEFl,CsSANDl,CsCLATHRINl和CsUBCl的穩(wěn)定性卻位列 前五。
[0005]microRNAOniRNA)是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小片段RNA，在基因的 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控上起到重要作用，對其表達(dá)水平的定量研究已成為一種常見實(shí)驗(yàn)，選擇合適的 內(nèi)參基因是確保實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)準(zhǔn)確性的先決條件。與具有編碼功能的基因 的定量分析有所不同，常用于miRNA熒光定量的內(nèi)參基因多為一些片段長度相對較短的 基因，如U6(smallnuclearRNA)、5.8S核糖體rRNA(5. 8SribosomalRNAprotein，5.8S rRNA)、5S核糖體rRNA(5SribosomalRNAprotein，5SrRNA)等，像GAPDH、18SrRNA等也 有使用。關(guān)于常用內(nèi)參基因穩(wěn)定性的爭議一直不斷，不少實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些常用內(nèi)參基因在不 同物種、組織以及試驗(yàn)處理下，其表達(dá)并不是恒定不變的。
[0006] 為了探討miRNA在茶樹低溫脅迫下的調(diào)控機(jī)制，篩選出低溫脅迫下穩(wěn)定表達(dá)的茶 樹miRNAqRT-PCR內(nèi)參基因，這也是開展miRNA差異表達(dá)的定量分析前需要解決的關(guān)鍵問 題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種茶樹低溫脅迫下miRNA熒光定量PCR內(nèi)參基因及其篩選 方法和應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
[0009] 一方面，本發(fā)明提供一種茶樹miRNA熒光定量PCR內(nèi)參基因PC-222-3P，其具有如 SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。
[0010] 另一方面，本發(fā)明提供一種茶樹miRNA熒光定量PCR內(nèi)參基因PC-222-3P的前體， 其具有如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列，該前體可在茶樹細(xì)胞內(nèi)被剪切且表達(dá)成miRNA Pc_222_3p〇
[0011] 再一方面，本發(fā)明還提供上述茶樹miRNA熒光定量PCR內(nèi)參基因PC-222-3P的篩 選方法，所述篩選方法包括如下步驟：
[0012] 1)選擇內(nèi)參候選基因及引物設(shè)計(jì)：
[0013]選擇 6 個(gè)植物miRNA內(nèi)參基因U6、18SrRNA、26SrRNA、5. 8SrRNA、5SrRNA和 GAPDH，另外選擇3個(gè)茶樹miRNAcs-miR396b、Pc-222-3p和Pc-45545-5p作為內(nèi)參候選基 因，其中，cs-miR396的核苷酸序列如SEQIDN0:3所示，Pc-45545-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，并設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物；
[0014] 2)內(nèi)參候選基因的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)：
[0015] 提取不同溫度處理下的茶樹成熟葉片和4°C下茶樹不同器官樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄 生成第一鏈miRNAcDNA，作為熒光定量PCR的模板，以步驟1)中設(shè)計(jì)的引物為熒光定量PCR 引物，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，獲得熒光定量PCR數(shù)據(jù)；
[0016] 3)內(nèi)參候選基因的穩(wěn)定性分析：
[0017] 利用BestKeeper和geNorm軟件對步驟2)中獲得的焚光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá) 穩(wěn)定性分析，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因；
[0018] 其中，用BestKeeper進(jìn)行Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)和變異系數(shù)（CV)分析，Ct值的 標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)和變異系數(shù)（CV)越小，基因表達(dá)穩(wěn)定性越高；用geNorm對基因表達(dá)穩(wěn)定度 的平均值M進(jìn)行分析，以基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值M作為評估內(nèi)參表達(dá)穩(wěn)定性的閾值，M值 越低，基因表達(dá)穩(wěn)定性越高。
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟1)中，所述內(nèi)參候選基因的熒光定量PCR引物為：
[0020] 1]6的正向引物1]6?如5￡〇10勵(lì):5所示，反向引物1]61?如5￡〇10勵(lì):6所示；
[0021] 18SrRNA的正向引物18SrRNAF如SEQIDN0:7所示，反向引物18SrRNAR如 SEQIDN0:8 所示；
[0022] 26SrRNA的正向引物26SrRNAF如SEQIDNO:9所示，反向引物26SrRNAR如 SEQIDN0:10 所示；
[0023] 5. 8SrRNA的正向引物 5. 8SrRNAF如SEQIDNO: 11 所示，反向引物 5. 8SrRNA R如SEQIDNO: 12 所示；
[0024] 5SrRNA的正向引物 5SrRNAF如SEQIDNO: 13所示，反向引物 5SrRNAR如SEQ IDNO: 14 所示；
[0025] 6六?011的正向引物6六?011?如5￡〇10勵(lì)：15所示，反向引物6六?0111?如5￡〇10 NO: 16所示；
[0026]cs-miR396b的正向引物cs-miR396bF如SEQIDN0:17 所示，反向引物 cs-miR396bR由miRNA熒光定量PCR試劑盒（miRcutemiRNAqPCRDetectionKit(SYBR Green))提供；
[0027]Pc-222-3p的正向引物Pc-222-3pF如SEQID勵(lì)：18所示，反向引物卩(：-222-3口 R由miRNA焚光定量PCR試劑盒（miRcutemiRNAqPCRDetectionKit(SYBRGreen))提 供；
[0028]Pc-45545-5p的正向引物Pc-45545-5pF如SEQIDNO: 19 所示，反向引物 Pc-45545-5pR由miRNA熒光定量PCR試劑盒（miRcutemiRNAqPCRDetectionKit(SYBR Green))提供。具體序列參見表l〇
[0029] 優(yōu)選地，所述步驟2)中，所述不同溫度處理指在25°C、4°C、0°C和_4°C下處理8小 時(shí)；所述不同器官包括成熟葉、芽、嫩莖、種子、根。
[0030] 優(yōu)選地，所述步驟2)中，所述熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性2min，94°C 變性20s，60°C退火延伸34s，40個(gè)循環(huán)，，然后進(jìn)行60~95°C溶解曲線分析，溶解曲線數(shù)據(jù) 由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動讀取。
[0031] 表1qRT-PCR中候選內(nèi)參基因的引物序列及擴(kuò)增長度
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