一種高效表達豬cyp1a1基因的真核表達載體構(gòu)建方法
【專利說明】
一、技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種高效表達豬CYPlAl基因的真核表達載體構(gòu)建方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
二、【背景技術(shù)】
[0002]CYPlAl基因?qū)偌?xì)胞色素P450家族成員，是機體代謝活化多烷芳烴、芳香胺類前致癌物質(zhì)主要功能酶，最新研究表明細(xì)胞色素P450在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。
[0003]目前，有關(guān)CYPlAl基因的報道多集中在人藥物代謝和腫瘤發(fā)生過程，通過酶活性、mRNA表達和基因水平探討CYPlAl的藥物代謝機理，揭示CYPlAl基因受芳香烴受體調(diào)控，激活四氯二苯-P-二惡英(TCDD)等前致癌物質(zhì)，產(chǎn)生高度親電子性代謝中間產(chǎn)物，對機體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子造成形態(tài)畸變、基因突變以及蛋白異常等，進一步引起細(xì)胞癌變。而對豬CYPlAl基因的研究報道少見，僅局限在mRNA表達分布上，提出豬CYPlAl基因在肝臟表達最高，其次是胃腸道和肺部組織。
[0004]但豬P450芳香酶的表達調(diào)控較其它脊椎動物復(fù)雜，有關(guān)豬CYPlAl基因的功能并不僅限于代謝酶類。本團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，豬CYPlAl基因在疫病感染炎性反應(yīng)過程中表達顯著改變，并與炎性反應(yīng)關(guān)系密切，預(yù)示豬CYPlAl基因在炎性反應(yīng)調(diào)控中可能發(fā)揮一定作用，而構(gòu)建豬CYPlAl基因真核表達載體是探討豬該基因分子功能的前提。因此，本發(fā)明闡述的一種高效表達豬CYPlAl基因的真核表達載體構(gòu)建方法，可實現(xiàn)豬CYPlAl基因在細(xì)胞甚至活體水平高效表達，為進一步探討豬CYPlAl基因在生理代謝、免疫反應(yīng)等方面的分子機能和調(diào)控途徑提供了方便與可能。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]1、技術(shù)問題
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種高效表達豬CYPlAl基因的真核表達載體構(gòu)建方法，包含用于高效、特異克隆豬CYPlAl基因的特異引物，特異擴增片段的粘性末端處理，實現(xiàn)高效表達真核載體的選擇。構(gòu)建的高效表達豬CYPlAl基因的真核載體轉(zhuǎn)化進目標(biāo)細(xì)胞或活體，將極大地促進研究者對豬CYPlAl基因結(jié)構(gòu)、功能及分子機理的探究。
[0007]2、技術(shù)方案
[0008]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0009]1、一種高效表達豬CYPlAl基因的真核表達載體構(gòu)建方法，其特征在于以下步驟:
[0010]I)豬CYPlAl基因的克隆
[0011]以豬肝組織樣為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GenBank中豬CYPlAl基因cDNA序列NCBI Reference Sequence:NM_214412.1為模板設(shè)計引物設(shè)計包含特異酶切位點和保護堿基的特異引物，應(yīng)用Primer STARMax高保真酶對豬CYPlAl基因編碼序列進行PCR擴增；擴增片段包含豬CYPlAl基因cDNA序列1551bp，酶切位點及保護堿基21bp，片段總長 1572bp。豬 CYPlAl 基因 cDNA 序列見 SEQ ID N0.1。
[0012]2)真核表達載體 pcDNA3.1 (+) /zeo-CYPlAl 的構(gòu)建
[0013]將CYPlAl基因連接到PMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌，提取菌株中pMD-18-T-CYPlAl重組質(zhì)粒，Xho1、NotI雙酶切鑒定后回收CYPlAl基因片段，同時用Xhol、NotI雙酶切處理pcDNA3.l/zeo(+)載體質(zhì)粒，利用T4連接酶與回收的CYPlAl基因片段進行連接后，轉(zhuǎn)化到DH5 a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，測序驗證，一種高效表達豬CYPlAl基因的真核表達載體pcDNA3.1/zeo (+)-CYPlAl構(gòu)建成功。
[0014]設(shè)計的特異引物為，
[0015]h游引物 CYP1A1-F:5’ -ATTTGCGGCCGCATGTTCTCTGTGTTTGGAC-3’ (SEQ ID N0.2)
[0016]下游引物CYP1A1-R:5’ -CCGCTCGAGCTAAGAGCGCACATGCA-3’ (SEQ ID N0.3)
[0017]PCR擴增目的片段回收、純化后，使用Taq酶進行加A尾處理，PCR產(chǎn)物14.5 μ 1，Taq buffer 2.0 μ I, dNTP 3μ1，5υ/μ1 Taq polymerase 0.5 μ 1，72°C孵育 20min，-20°C
保存?zhèn)溆?，便于克隆載體構(gòu)建。
[0018]所述的高效表達豬CYPlAl基因的真核表達載體pcDNA3.1/zeo (+)-CYPlAl可以在制備功能藥物中得到應(yīng)用，特別是指在制備與炎性反應(yīng)相關(guān)的功能藥物中應(yīng)用。
[0019]3、有益效果
[0020]本發(fā)明針對豬CYPlAl基因的分子機能研究，提供了一種高效表達豬該基因的真核表達載體的構(gòu)建方法，用于細(xì)胞及活體水平的豬CYPlAl基因代謝調(diào)控、免疫反應(yīng)等生物學(xué)功能研究與驗證，具很好的實際意義和應(yīng)用價值，目前未見其它報道。
[0021]本發(fā)明通過研究，確定了適合豬CYPlAl基因特異克隆并利于載體構(gòu)建的特異引物SEQ ID NO: 1-2，優(yōu)化了載體構(gòu)建的處理手段與條件，明確了適合豬CYPlAl基因功能研究的質(zhì)粒載體。
[0022]針對豬CYPlAl基因具藥物代謝酶功能，特別選用pcDNA3.1/zeo (+)作為真核質(zhì)粒載體，利用其高效增強子SV40及高效啟動子T7PCMV，促進CYPlAl基因高效表達；并可同時借助pcDNA3.1 (+)/zeo載體的Zeocin抗性，在轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞時篩選特異抗性克隆。
[0023]炎性調(diào)控功能不屬于藥物代謝酶功能范疇；炎性調(diào)控功能是在運用本發(fā)明構(gòu)建的真核表達載體表達的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)的；選用pc DNA 3.1載體是根據(jù)該基因具有藥物代謝酶特征，為基因表達后能用于后續(xù)研究實驗特別選用的。應(yīng)用本發(fā)明闡述的方法構(gòu)建出的高效表達豬CYPlAl基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染進豬PAM細(xì)胞，建立起過表達豬CYPlAl基因PAM細(xì)胞系，用于豬肺炎支原體(Mhp)細(xì)胞感染實驗，通過對炎性反應(yīng)調(diào)控通路關(guān)鍵受體及炎性因子表達水平的動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在肺炎支原體感染PAM細(xì)胞的炎性反應(yīng)過程中，豬CYPlAl基因與炎癥反應(yīng)調(diào)控受體PPAR- γ的表達存在明顯的正相關(guān)，并通過調(diào)控PPAR- γ受體表達間接實現(xiàn)對NF-kB、NFAT等炎癥活化因子的調(diào)控，從而影響機體炎性反應(yīng)過程，發(fā)揮抑炎作用。這一重大發(fā)現(xiàn)對豬CYPlAl基因的分子功能研究具有深遠(yuǎn)的意義，更能有效促進豬支原體肺炎發(fā)生的分子基礎(chǔ)研究工作。
[0024]而且，應(yīng)用該高效表達豬CYPlAl基因真核表達載體轉(zhuǎn)染其它相關(guān)功能細(xì)胞，甚至活體豬特定組織部位，開展細(xì)胞代謝、病原感染，以及活體轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灒転檫M一步揭示豬CYPlAl基因的生物學(xué)功能提供可能和技術(shù)支撐，有益效果顯著。
四、【附圖說明】
[0025]圖1.豬CYPlAl基因真核表達載體構(gòu)建過程示意圖
[0026]圖2.豬CYPlAl基因擴增及克隆載體構(gòu)建效果示例
[0027]M:DNAMarker (片段大小如圖示)
[0028]圖A:豬CYPlAl基因PCR擴增結(jié)果示例
[0029]圖B:重組pMD18-T-CYPlAl菌液PCR鑒定示例
[0030]圖C:重組質(zhì)粒雙酶切后電泳示例
[0031]圖3.豬CYPlAl基因真核表達載體酶切鑒定效果
[0032]其中:M:DNAMarker(片段大小如圖示)；1_2 泳道為 pcDNA3.1 (+)/zeo-CYPlAl 雙酶切，3-4泳道為pcDNA3.1 (+) /zeo，5-6泳道為Notl單酶切，7-8泳道為Xhol單酶切，9-10泳道為 pcDNA3.1 (+) /zeo-CYPlAl.
[0033]圖4豬CYPlAl基因真核表達載體轉(zhuǎn)染后表達效果鑒定
[0034]圖A:真核表達載體轉(zhuǎn)化后重組細(xì)胞系RT-PCR檢測結(jié)果(泳道1:正常細(xì)胞擴增片段；泳道2:重組細(xì)胞PCR擴增片段)；
[0035]圖B:Western-blot表達量灰度值效果圖(1_2組:空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞，3組:正常細(xì)胞，4-6組:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞).
[0036]圖5:不同處理組PAM細(xì)胞系感染豬肺炎支原體(Mhp)后PPAR- γ的表達變化
[0037]圖Α:豬CYPlAl基因過表達PAM細(xì)胞系中PPAR- γ隨Mhp感染的表達變化
[0038]圖B:轉(zhuǎn)染空載體的豬PAM細(xì)胞系中PPAR- γ隨Mhp感染的表達變化
[0039]圖C:豬CYPlAl基因正常表達(無轉(zhuǎn)染處理)PAM細(xì)胞系中PPAR-γ隨Mhp感染的表達變化
[0040]*表示與正常對照組差異顯著(0.01<Ρ<0.05) ;**表示與正常對照組差異極顯著(Ρ〈0.01)
五、【具體實施方式】
[0041]下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。本實施例僅用于說明本發(fā)明但不用于限制本發(fā)明范圍。實施例中未注明的具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件進行，如分子克隆實驗手冊所述條件或制造廠商建議條件。