枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法，本 發(fā)明特別涉及幾種新型的芽孢衣殼蛋白為分子載體將外源蛋白基因與其整合到一起，從而 篩選出能夠高通量展示目的蛋白量的分子載體，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 海藻糖是由兩個葡萄糖分子以a，a，1，1一糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，在高溫、 高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下能穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，有效地保護(hù) 細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程和生物特征。在海藻糖的工 業(yè)生產(chǎn)中，海藻糖合酶與其它海藻糖合成酶相比具有更大的優(yōu)勢，海藻糖合酶海藻糖合酶 (TreS)是一類分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶，專一性地以生產(chǎn)原料為更加廉價的麥芽糖為底物，一步轉(zhuǎn) 化生成海藻糖，操作工藝簡單、底物價格低廉、應(yīng)用前景良好。
[0003]芽胞表面展示技術(shù)是將外源蛋白基因與含有自身啟動子的芽胞衣殼蛋白基因融 合，構(gòu)建融合基因表達(dá)載體，然后將這種載體轉(zhuǎn)化到產(chǎn)芽胞的宿主菌株，得到的重組菌株在 生孢培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，外源目的基因就會在外套蛋白基因啟動子的啟動下表達(dá)，并通過與 外套蛋白偶聯(lián)的作用將外源蛋白展示在芽胞的表面。在面臨營養(yǎng)缺乏和其他逆境脅迫時， B.subtilis會自發(fā)形成特殊的休眠體一一芽孢，抵御不良環(huán)境帶來的危害。當(dāng)外界環(huán)境適 宜后，芽孢萌發(fā)形成具有正常生理活性的營養(yǎng)體。芽孢一般由核心、皮層、芽孢衣殼和芽孢 外壁組成。芽胞表面展示系統(tǒng)由載體蛋白、目的蛋白和宿主3部分組成，每一部分都是表面 展示系統(tǒng)構(gòu)建成功的關(guān)鍵。在選定芽胞外套蛋白作為錨定蛋白時不僅要考慮它所處的位置 還要考慮其豐度。
[0004]芽胞桿菌中高效表達(dá)外源蛋白的最大障礙是構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒在宿主菌中通 常不穩(wěn)定，解決這一問題的最有效途徑是使用整合型質(zhì)粒。整合型質(zhì)粒只在大腸桿菌中有 復(fù)制功能，轉(zhuǎn)入革蘭氏陽性細(xì)菌如枯草芽胞桿菌中則無此功能，因此只有整合到宿主菌的 基因組才能正常的表達(dá)目的基因。該發(fā)明所用的芽胞桿菌標(biāo)記基因是抗生素抗性基因。
[0005] 海藻糖合酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于海藻糖的工業(yè)生產(chǎn)，并大大降低了海藻糖生產(chǎn)的成 本。但如何進(jìn)一步提高海藻糖合酶的酶活力和轉(zhuǎn)化率仍然是目前研究的熱點。利用生物信 息學(xué)的知識，通過飽和突變或定點突變技術(shù)對海藻糖合酶基因進(jìn)行遺傳學(xué)改造，改變酶活 性中心附近以及與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸序列，極有可能獲得酶活更高和穩(wěn)定性更高的海 藻糖合酶。因此，通過構(gòu)建融合表達(dá)載體，將海藻糖合酶基因通過芽孢表面展示技術(shù)展示在 芽孢表面，可以通過酶活觀察目的蛋白的生成量，成為研究解決上述問題的一種途徑。
[0006] 由于不同的芽孢衣殼蛋白的分子結(jié)構(gòu)，以及在芽孢中的組成存在差異，單只不同 的芽孢衣殼蛋白做為分子載體，表面展示外源蛋白的重組芽孢的生物學(xué)活性也不同。目前 已經(jīng)有20多種報道出來的枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白，但是部分蛋白可能只起到調(diào)控或 是運輸其他衣殼蛋白的作用，并不具備作為分子載體表面展示外源蛋白的作用。現(xiàn)如今已 經(jīng)報道出來用作分子載體的Cot芽孢衣殼蛋白有CotB、CotC、CotG、CotX、CotZ等。但由于 酶受空間結(jié)構(gòu)影響較大，這些Cot芽孢衣殼蛋白與目的蛋白結(jié)合后是否會影響目的蛋白的 表面展示，目前還沒有研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白Cot表面展示 海藻糖合酶的方法。該方法通過篩選不同的芽孢衣殼蛋白作為載體蛋白，經(jīng)芽孢表面展示 技術(shù)將外源蛋白海藻糖合酶展示在枯草芽孢桿菌的芽孢表面，篩選出具有高展示量的載體 蛋白。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] -種枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法，包括如下步 驟：
[0010] (1)提取枯草芽孢桿菌的基因組DNA，然后以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增枯草芽孢 桿菌芽孢衣殼蛋白基因，PCR擴(kuò)增過程中，在上游和下游引物中分別引入BamHI和Xbal酶 切位點，制得枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因Cot;
[0011] 所述枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotG、 枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotB、枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotC、枯草芽孢桿 菌芽孢衣殼蛋白基因CotD、枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotH、枯草芽孢桿菌芽孢衣殼 蛋白基因CotX、枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotY或枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因 CotZ；
[0012] (2)以惡臭假單胞桿菌基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，制得海藻糖合成酶TreS的核苷 酸序列；
[0013] (3)去除步驟（1)制得的枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因Cot的終止子，然后采用 融合PCR與步驟（2)制得的TreS基因進(jìn)行融合，融合PCR過程中，在上游和下游中分別引 入限制性內(nèi)切酶BamHI和Aatll的酶切位點，制得融合基因Cot-TreS;
[0014] (4)將步驟（3)制得的融合基因Cot-TreS經(jīng)BamHI和Aatll雙酶切后，與同樣經(jīng) BamHI和Aatll雙酶切的表達(dá)載體pHTOl連接，制得重組質(zhì)粒pHT01-Cot-TreS;
[0015] (5)將步驟（4)制得的重組質(zhì)粒pHT01-Cot-TreS轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis) 168 (trp)，轉(zhuǎn)化后經(jīng)涂布含氯霉素的LB平板進(jìn)行篩選，然后經(jīng)碘液顯色方式進(jìn) 行轉(zhuǎn)化子鑒定，獲得陽性菌株；
[0016] (6)將步驟（5)制得的陽性菌株經(jīng)DSM培養(yǎng)基35~37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)45~50h，制得 表面展示海藻糖合酶的重組芽孢。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因為枯草芽孢 桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotG;
[0018] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotG的PCR擴(kuò)增引物，核苷 酸序列如下：
[0019] CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
[0020] CotG-R：GCTGGGTCATTCTAGATTTGTATTTCTTTTTGACTACC
[0021] PCR擴(kuò)增體系如下，總體積50yL:
[0022] 2XHiFi-PCR Master 25 y L，引物CotG-F 2. 5 y L，引物CotG-R 2. 5 y L，Bacillus subtilis 168基因組2.5yL，ddH20 17.5yL;
[0023] PCR擴(kuò)增程序如下：
[0024] 95°C預(yù)變性 5min;95°C變性 30s，48°C退火 30s，72°C延伸IminlOs，共 30 個循環(huán)； 72°C繼續(xù)延伸lOmin。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)168；
[0026] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中PCR的擴(kuò)增引物，核苷酸序列如下：
[0027] TreS-F ：TAAGTATTTTATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
[0028] TreS-R ：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT；
[0029] PCR擴(kuò)增體系，總體積50 y 1 :
[0030] 2XHiFi-PCR Master 25 y L，引物TreS-F 2. 5 y L，引物TreS-R 2. 5 y L， pET15b-TreS 2. 5 y L, ddH20 17. 5 y L；
[0031] PCR擴(kuò)增程序如下：
[0032] 95°C預(yù)變性 5min;95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸lmin30s，共 30 個循環(huán)； 72°C繼續(xù)延伸lOmin。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)來源于 美國模式培養(yǎng)物集存庫，保藏編號：ATCC47054。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)中去除枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotG的 終止子的步驟如下：
[0035] 在設(shè)計引物時，人為的去除枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白基因CotG的終止密碼子， 插入酶切位點Aatll。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)中去除TreS基因的終止子的步驟如下：
[0037] 在設(shè)計引物時，人為的去除海藻糖合酶基因TreS的終止密碼子TGA，插入酶切位 點Aatll〇
[0038] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)中融合PCR采用二次融合PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物核 苷酸序列如下：
[0039] CotG-F ：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
[0040] TreS-R ：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT；
[0041] 第一輪融合PCR擴(kuò)增體系如下，總體積25 y 1 :
[0042]2XHiFi-PCR Master 12. 5 y L，膠回收產(chǎn)物CotG 2 y L，膠回收產(chǎn)物TreS 2 y L， ddH20 8. 5 y L；
[0043] 第一輪融合PCR擴(kuò)增程序如下：
[0044] 95°C預(yù)變性 5min;95°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 4min，5 個循環(huán)；72°C繼 續(xù)延伸l〇min。
[0045] 第二輪融合PCR擴(kuò)增體系為在第一輪PCR體系的基礎(chǔ)上補加如下試劑：
[0046] 2 XHiFi-PCR Master 12. 5 yL，引物CotG-F 1 yL，引物TreS-R 1 yL，ddH20 10. 5 yL；
[0047]第二輪融合PCR擴(kuò)增程序如下：
[0048] 95°C預(yù)變性 5min;95°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 5min30s，共 30 個循環(huán)； 72°C繼續(xù)延伸lOmin。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（4)中連接體系如下，總體積10yL:
[0050] CotG-TreS4yL，表達(dá)載體pHT013yL，5XT4buffer2yL，T4 連接酶 1yL;
[0051] 連接條件為：16 °C連接過夜。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（6)中的DSM培養(yǎng)基組分如下：
[0053] 0?8wt% 肉湯培養(yǎng)液，0?lwt%KC1，0.025wt%MgS04 ? 7H20,1. OMm Ca(N03)2,10 yM FeS04〇
[0054] 以CotG為分子載體時，每毫升芽孢懸浮液的酶活力為0. 63U/mg，表明CotG可以作 為表面展示海藻糖合酶的分子載體。
[0055] 有益效果
[0056] 1、本發(fā)明利用Cot系列芽孢衣殼蛋白作為芽孢表面展示外源蛋白的分子載體，設(shè) 計出Cot分子載體的系列引物，通過雙酶切既可以替換分子載體又可以更改外源目的蛋 白，最后通過基因技術(shù)將海藻糖合酶展示于枯草芽孢桿菌芽孢表面，篩選出可以高效展示 海藻糖合酶的芽孢衣殼蛋白。高效展示在芽孢表面的海藻糖合酶，無抗菌活性，達(dá)到食品應(yīng) 用酶制劑要求，有利于下一步海藻糖的生產(chǎn)制造。
[0057] 2、本方法選擇的Cot系列的芽孢衣殼蛋白基因作為表面展示蛋白的分子載體，選 擇具有保護(hù)性抗原蛋白和具有催化活性的海藻糖合酶基因為目的基因，以具有轉(zhuǎn)化能力、 安全性高且可產(chǎn)生芽孢的枯草芽孢桿菌菌株（如Bacillussubtilis168菌株）作為重組 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株，可通過測定酶活或其他手段檢測芽孢表面展示的海藻糖合酶量。
【具體實施方式】
[0058] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0059] 本方法中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理 解的含義。
[0060] 在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的和各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方 法。所用試劑的來源、商品名稱以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后 所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0061] 菌株來源：
[0062] 實施例中的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis) 168,購自杭州寶 賽生物有限公司。
[0063] 實施例中的惡臭假單孢菌（Pseudomonasputida)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫 (Americantypeculturecollection)，菌種編號ATCC47054。
[0064] 表達(dá)載體pHTOl購自杭州寶賽生物有限公司。
[0065] 實施例1
[0066] 以CotB為分子載體在枯草芽孢桿菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重組芽孢的 制備。
[0067] 枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotB基因的獲得
[0068] 將培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌菌液按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書 提取枯草芽孢桿菌168基因組DNA。另外根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中CotB基因的編碼序列設(shè)計引 物，在上游和下游引物中分別引入BamHI和Xbal酶切位點，引物由生工生物工程（上海）股 份有限公司。采用寶生物工程有限公司的2XHiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢 桿菌基因組DNA為模板擴(kuò)增CotH。引物核苷酸序列如下，其中下劃線代表的是酶切位點。
[0069]CotB-F：GGATCCATGAGCAAGAGGAGAATGAAA
[0070]CotB-R：TGGGTCATAAATTTACGTCTAGATTTCCAGT；
[0071]PCR擴(kuò)增體系如下，總體積50y1 :
[0072] 2XHiFi-PCRMaster25yL，引物CotB-F2. 5yL，引物CotB-R2. 5yL，Bacillus subtilis168基因組 2.5yL，ddH20 17.5yL;
[0073] PCR擴(kuò)增程序如下：
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