一種聚球藻基因在制備適用于亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候區(qū)生長的水稻中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藍藻基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種聚球藻基因在制備適用于亞熱帶季 風(fēng)性濕潤氣候區(qū)生長的水稻中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（sativaL.)是世界上最重要的糧食作物之一，70年代培育成功的三系雜交 水稻是我國水稻育種事業(yè)的重大突破。但是，三系法雜交水稻是建立在質(zhì)核互作型雄性不 育系基礎(chǔ)之上的，在三系法（不育系、保持系、恢復(fù)系）雜交水稻的應(yīng)用過程中，種子生產(chǎn)要 經(jīng)過兩個步驟；恢復(fù)系在現(xiàn)有品種中存在的比例也很低；三系不育系的細胞質(zhì)對雜種的產(chǎn) 量性狀存在有不同程度的負效應(yīng)，影響了雜種優(yōu)勢的充分發(fā)揮。兩系法雜交水稻是建立在 光溫敏核不育系的基礎(chǔ)之上的，這類不育系的花粉育性隨發(fā)育期間所經(jīng)歷的不同光照長度 或不同的高低溫度而表現(xiàn)出不育或可育，在不育的時期用做母本進行制種，在可育的時期 用來自身繁殖，不需要保持系。所以稱為兩系法雜交水稻。兩系法雜交水稻比三系法雜交 水稻具有更加深遠的意義（尹華奇，1997年）。
[0003] 廣占63s是用N422s與矮廣占63雜交后自交選育成的光溫敏感型核不育系，已 經(jīng)組配了較多組合，有些組合因不育系純度不夠，在生產(chǎn)實踐中存在諸如不育系繁殖去雜、 制種母本去雜、雜交種純度鑒定難等問題，如能用隱性標(biāo)記性狀標(biāo)記純度，可解決上述問題 (陳庭木，2010年）。廣占63黃華苗（或稱廣占63黃葉突變體）是廣占63S-隱性基因 發(fā)生突變得到的突變體，該突變體葉片黃色，可作為篩選標(biāo)記。但是由于該基因的突變，導(dǎo) 致該突變體在長江流域（以武漢為例）生長緩慢，不分蘗不結(jié)籽，因而失去了其不育系的作 用。目前廣占63黃華苗僅在海南可生長，分蘗并結(jié)籽，實現(xiàn)其不育系的作用。
[0004] 本發(fā)明將聚球藻7002的基因SYNPCC7002_A0987通過分子手段轉(zhuǎn)入到廣占63黃 華苗中，得到新的轉(zhuǎn)987基因突變株。新的轉(zhuǎn)987基因突變株能部分回補廣占63黃華苗的 生長性狀，使其在長江流域能夠生長，能分蘗并且結(jié)籽，并且?guī)в悬S色選擇標(biāo)記，恢復(fù)其不 育系的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種聚球藻基因在制備適用于亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候區(qū) 生長的水稻中的應(yīng)用，所述的聚球藻基因為SEQIDNO. 1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQID NO. 2所示。將該基因通過轉(zhuǎn)基因手段轉(zhuǎn)入廣占63黃華苗（本發(fā)明或稱廣占63黃葉突變 體）中，得到的轉(zhuǎn)基因水稻在武漢地區(qū)生長分蘗且結(jié)籽。
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0007] -種聚球藻基因在制備適用于亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候區(qū)生長的水稻中的應(yīng)用，將 SEQIDNO. 1所示的基因通過分子生物學(xué)的方式轉(zhuǎn)入廣占63黃華苗中，獲得的轉(zhuǎn)基因植株 可在武漢地區(qū)生長分蘗且結(jié)籽。
[0008] 更詳細的方案請詳見【具體實施方式】。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0010] 本發(fā)明將聚球藻7002的基因SYNPCC7002_A0987通過分子手段轉(zhuǎn)入到廣占63黃 葉突變體中，得到新的轉(zhuǎn)987基因突變株。新的轉(zhuǎn)987基因突變株能部分回補廣占63黃葉 突變體的生長性狀，使其在長江流域能夠生長，能分蘗并且結(jié)籽，并且?guī)в悬S色選擇標(biāo)記， 恢復(fù)其不育系的作用。黃葉不育系在繁殖與制種過程中可以將全部青葉株去除，在雜交種 應(yīng)用時將黃葉株去除或移栽時剔除。依靠黃葉不育系自身攜帶的黃色選擇標(biāo)記，可在生產(chǎn) 實踐中解決不育系繁殖去雜、制種母本去雜、雜交種純度鑒定難等問題。
【附圖說明】
[0011] 圖1為基因SYNPCC7002_A0987轉(zhuǎn)化廣占63黃葉突變體（D31)PCR檢測結(jié)果圖。
[0012] 圖2為目的基因SYNPCC7002_A0987轉(zhuǎn)化廣占63黃華苗生長情況圖。
[0013] 圖3為廣占63黃葉突變體生長情況圖。
[0014] 圖4為目的基因SYNPCC7002_A0987轉(zhuǎn)化廣占63黃華苗F1代生長情況圖。
【具體實施方式】
[0015] 本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所述試劑或原料， 如未特別說明，均來自于商業(yè)渠道。
[0016] 實施例1 :
[0017] 一種聚球藻基因在制備適用于亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候區(qū)生長的水稻中的應(yīng)用，應(yīng) 用過程包括：
[0018] 1)以提取的野生型聚球藻？0：7002(571^^11〇(3〇(^118 8口.？0：7002)基因組（編號 NC_010475. 1)為模板，引物 987F/987R擴增基因SYNPCC7002_A0987,編號gi|169885277。 PCR條件為 94°C4min預(yù)變性，94°C30s，55°C30s，72°Clmin，共 35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 10min〇
[0019] 987F:GTGATTACCCTCGCTGAACCC，987R:ACATCCAATAACCAAGAGCCCAA
[0020] 2)PCR產(chǎn)物電泳后切膠，用DNA凝膠回收試劑盒回收（AXYGEN公司）。連接體系包 括PCR回收產(chǎn)物4ul，T載體（pEASY-Tl，全式金生物技術(shù)有限公司）0. 8ul，輕輕混合，25°C 恒溫培養(yǎng)15min。于超凈臺中將連接體系加入到50ul大腸菌感受態(tài)細胞（Transl-Tl，全 式金生物技術(shù)有限公司）之中，冰浴30min，42°C熱擊90s。冰浴2min后加入500ulLB培 養(yǎng)基，37°C，180r/min恢復(fù)1小時。將菌液6000r/min離心lmin，吸棄上清液400ul，向剩 余的100ul加入50ulX-gal(25mg/ml)和5ulIPTG(lmol/L)，將菌液均勻的涂在氨芐抗性 (Amp+)LB平板上，37°C溫箱倒置過夜。得到陽性重組質(zhì)粒987-T1。
[0021] 3)用限制性內(nèi)切酶BamHl和Xbal雙酶切重組質(zhì)粒987-T1和水稻表達載體 pBWA(V)HS(武漢伯遠生物技術(shù)有限公司提供），電泳檢測酶切結(jié)果，切膠回收酶切產(chǎn)物。經(jīng) 純化的基因片段SYNPCC7002_A0987和純化的pBWA(V)HS載體片段按摩爾比1:3混合，在連 接酶作用下，16°C水浴過夜酶連。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體pBWA(V)HS-A0987。
[0022] 3)將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌中。取農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，冰上融化以后，加入 lug構(gòu)建好的質(zhì)粒pBWA(V)HS-A0987DNA，混勻，依次置于冰浴、液隊和37°C水浴中各5min， 加入800微升新鮮的YM培養(yǎng)基，于28°ClOOrpm振蕩培養(yǎng)2-4小時。取200uL涂布于含潮 霉素的YM培養(yǎng)基上，28°