毒蛋白表達(dá)變化，結(jié)果如圖10中B所示， sgIE-1敲出的細(xì)胞相對(duì)sgMock處理后，早期蛋白IE-1直到24hp.i.才能檢測(cè)到微弱的條 帶，晚期蛋白VP39到48hp.i.才能夠檢測(cè)到明顯的蛋白條帶，同樣極晚期蛋白Poly直到 48hp.i.都沒有檢測(cè)到蛋白表達(dá)。總體蛋白表達(dá)相對(duì)sgMock處理的細(xì)胞延遲24h以上，這 一結(jié)果充分說明了Cas9的敲出效率是非常明顯的。最后，對(duì)sgIE-1敲出的細(xì)胞的病毒感 染力TCID5。進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖10中C所示，發(fā)現(xiàn)sgIE-1敲出的細(xì)胞相對(duì)sgMock病毒 毒力下降3-4個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0057] 實(shí)施例3、穩(wěn)定表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)抑制BmNPV增殖效果檢測(cè)
[0058]Invitrogen公司開發(fā)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pIZ_V5/His含有Zeocin抗性基因，通 過長(zhǎng)時(shí)間抗生素篩選可以獲得穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞系。為了提高抗基因編緝載體的抗 病毒效果，將基因編緝載體pIZ-Cas9-Mcherry-U6_sgMock和pIZ-Cas9-Mcherry-U6_sgIEl轉(zhuǎn)染到BmN-SWUl細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)穩(wěn)定后用含400 y g/mL濃度的Zeocin抗生素的培養(yǎng) 基篩選陽(yáng)性細(xì)胞一周左右，大量細(xì)胞死亡后逐步降低抗生素濃度，最后穩(wěn)定培養(yǎng)。結(jié)果如圖 11所示，大概篩選兩個(gè)月左右基本95%以上的細(xì)胞都含有目的蛋白的表達(dá)，證明這個(gè)細(xì)胞 能夠穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，可以用于抗病毒研究。
[0059] 用穩(wěn)定表達(dá)基因編緝載體的細(xì)胞感染BmNPV，72小時(shí)后熒光觀察 pIZ-Cas9-Mcherry-U6_sgMock和pIZ-Cas9-Mcherry-U6_sgIEl穩(wěn)定細(xì)胞系的病毒復(fù)制情 況，結(jié)果如圖12所示，穩(wěn)定表達(dá)sgMock的細(xì)胞病毒感染基本不受影響，而sgIE-1穩(wěn)定細(xì)胞 系基本檢測(cè)不綠色熒光，通過熒光統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)sgMock感染率達(dá)100%，sgIE-1 穩(wěn)定細(xì)胞系只達(dá)到5%左右，表明sgIE-1系統(tǒng)具有非常明顯的抗病毒效果。
[0060] 為了充分證明含有基因編緝系統(tǒng)地穩(wěn)定細(xì)胞系能夠充分抑制病毒增殖，對(duì)感染病 毒的SgMock和SgIE-1穩(wěn)定細(xì)胞系的病毒感染力TCID5。進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖13所示，發(fā) 現(xiàn)sgIE-1基因編緝的細(xì)胞相對(duì)sgMock病毒毒力下降6-7個(gè)數(shù)量級(jí)，sgIE-1基因編緝的細(xì) 胞基本沒有再次感染能力。
[0061] 實(shí)施列4、病毒誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建及分析
[0062] 目前，CRISPR/Cas9基因編緝技術(shù)已經(jīng)迅速應(yīng)用于人類疾病基因治療及基因工程 研究，但是Cas9的脫靶現(xiàn)象仍然困擾著大多數(shù)基因編緝研究學(xué)者，雖然有很多策略能夠降 低之中脫靶效率，但是并沒有一種方法能夠徹底避免脫靶。因此，進(jìn)一步利用構(gòu)建的病毒誘 導(dǎo)型39K啟動(dòng)子來啟動(dòng)這一基因編緝載體，利用先前同樣的方法把Hr3-39K啟動(dòng)子經(jīng)過Xho I/ClaI酶切連接到相應(yīng)的載體上，轉(zhuǎn)化、挑取陽(yáng)性克隆、酶切驗(yàn)證。其中Hr3-39K啟動(dòng)子序 列為SEQIDNo. 18。載體命名pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6為這一系統(tǒng)在病毒感染后能夠 啟動(dòng)子迅速被病毒激活，然后表達(dá)Cas9蛋白，從而編輯病毒基因，病毒誘導(dǎo)型基因編緝?cè)?理如圖14所示。
[0063]為了更精確的驗(yàn)證病毒誘導(dǎo)型基因編緝系統(tǒng)地編輯的效率，首先轉(zhuǎn)染pHr3-39K-Cas9_Mcherry-U6載體48小時(shí)后，在不同時(shí)間點(diǎn)加入病毒，通過mRNA水平和蛋白 水平檢測(cè)Cas9被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和翻譯的時(shí)間。結(jié)果如圖15中A所示，病毒感染后，6小時(shí)就能 檢測(cè)Cas9基因開始轉(zhuǎn)錄，一直持續(xù)增加到24小時(shí)，Cas9蛋白24小時(shí)就能檢測(cè)到大量的表 達(dá)，說明這個(gè)基因編緝系統(tǒng)在病毒感染后能夠迅速轉(zhuǎn)錄翻譯，從而編緝病毒基因，從而達(dá)到 抗病毒效果。
[0064] 同理為了檢測(cè)這個(gè)基因編緝系統(tǒng)對(duì)病毒的敏感性，分別用M0I為100、50、20和5 的病毒滴度來感染過表達(dá)pHr3-39K-CaS9-Mcherry-U6載體的細(xì)胞。感染48小時(shí)后，分別 提取RNA和蛋白檢測(cè)Cas9轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，結(jié)果如圖15中B所示，不同濃度的病毒滴度對(duì) Cas9轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)并沒有顯著的差異，結(jié)果說明我們構(gòu)建的病毒誘導(dǎo)型基因編緝載體能 夠在極微量的病毒感染后就能夠被激活，能夠快速反映，抑制病毒大規(guī)模擴(kuò)增。
[0065] 實(shí)施列5、病毒誘導(dǎo)型CRISPR/Cas9系統(tǒng)抗病毒分析
[0066] 為了提高抗基因編緝載體的抗病毒效果，將基因編緝載體pHr3-39K-Cas9-Mc herry-U6-sgMock(pIZ-Cas9-Mcherry-U6_sgMock載體的啟動(dòng)子由Hr3_39K替換）和 pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6-sgIE-l轉(zhuǎn)染到BmN-SWUl細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)穩(wěn)定后用含 400ug/mL濃度的Zeocin抗生素的培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性細(xì)胞一周左右，大量細(xì)胞死亡后逐步降 低抗生素濃度，最后穩(wěn)定培養(yǎng)。大概篩選兩個(gè)月左右基本95%以上的細(xì)胞都含有目的蛋白 的表達(dá)，證明這個(gè)細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，可以用于抗病毒研究。
[0067]用穩(wěn)定表達(dá)基因編緝載體的細(xì)胞感染BmNPV，72小時(shí)后熒光觀察pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6_sgMock和pHr3-39K-Cas9-Mcherry-U6-sgIE_l穩(wěn)定細(xì)胞系 的病毒復(fù)制情況，結(jié)果如圖16所示，穩(wěn)定表達(dá)sgMock的細(xì)胞病毒感染基本不受影響，而 sgIE-1穩(wěn)定細(xì)胞系基本檢測(cè)不綠色熒光，通過熒光統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)sgMock感染率 達(dá)100%，sgIE-1穩(wěn)定細(xì)胞系只達(dá)到5 %左右，這一系統(tǒng)具有非常明顯的抗病毒效果。
[0068] 為了說明含有病毒誘導(dǎo)型基因編緝系統(tǒng)的穩(wěn)定細(xì)胞系能夠充分抑制病毒增殖，對(duì) 感染病毒的sgMock和sgIE-1病毒誘導(dǎo)型穩(wěn)定細(xì)胞系的病毒感染力TCID5。進(jìn)行了分析，結(jié) 果如圖17所示，sgIE-1基因編緝的細(xì)胞基本沒有再次感染能力，這一結(jié)果充分證明了構(gòu)建 的病毒誘導(dǎo)型基因編緝系統(tǒng)能夠快速敏感的抑制病毒增殖復(fù)制。
[0069] 最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在 形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. Cas9介導(dǎo)的家蠶基因編輯載體，其特征在于：包括U6啟動(dòng)子調(diào)控sgRNA表達(dá)的表達(dá) 框U6-sgRNA和IE-I啟動(dòng)子調(diào)控Cas9表達(dá)的表達(dá)框。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述Cas9介導(dǎo)的家蠶基因編輯載體，其特征在于：還包括熒光標(biāo)記 系統(tǒng)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述Cas9介導(dǎo)的家蠶基因編輯載體，其特征在于：所述熒光標(biāo)記系 統(tǒng)為Mcherry紅色焚蛋白。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述Cas9介導(dǎo)的家蠶基因編輯載體，其特征在于：所述Cas9的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述表達(dá)框U6-sgRNA含有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序 列，所述IE-I啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述Cas9介導(dǎo)的家蠶基因編輯載體，其特征在于：所述Mcherry紅 色熒蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述Cas9介導(dǎo)的家蠶基因編輯載體，其特征在于：所述Cas9由SEQ ID NO. 18所示的Hr3-39k誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述Cas9介導(dǎo)的家蠶基因編輯載體，其特征在于：所述 sgRNA為egfp基因的sgRNA或ie-1基因的sgRNA ;所述egfp基因的sgRNA的核苷酸序列 含有如SEQ ID NO. 5~10所示中的任意一條或兩條；所述ie-1基因的sgRNA的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 11~16所示中的任意一條或兩條。8. 含有權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述Cas9介導(dǎo)的家蠶基因編輯載體的轉(zhuǎn)化體。9. 權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述Cas9介導(dǎo)的家蠶基因編輯載體在昆蟲基因功能研究或 家蠶抗BmNPV品系基因工程育種中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了Cas9介導(dǎo)的家蠶基因編輯載體，包括組成型基因編輯載體和誘導(dǎo)型基因編輯載體，其中組成型基因編輯載體包括U6啟動(dòng)子調(diào)控sgRNA表達(dá)的表達(dá)框U6-sgRNA和IE-1啟動(dòng)子調(diào)控Cas9表達(dá)的表達(dá)框，誘導(dǎo)型基因編輯載體Cas9由Hr3-39k誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)，本發(fā)明的Cas9介導(dǎo)的基因編輯載體能夠穩(wěn)定、高效編輯目的基因，為制備昆蟲抗病毒轉(zhuǎn)基因素材和具有高效抗病毒的品種提供了有力的工具。
【IPC分類】C12N15/85, A01K67/04, C12N5/10
【公開號(hào)】CN105132460
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510630939
【發(fā)明人】潘敏慧, 魯成, 董戰(zhàn)旗, 胡楠, 陳婷婷, 陳鵬
【申請(qǐng)人】西南大學(xué)
【公開日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年9月29日