一種建立胰腺癌模型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物模型的建立方法，具體涉及利用慢病毒介導(dǎo)癌基因的過(guò)表達(dá)及抑癌基因的敲降以誘導(dǎo)樹(shù)駒胰腺癌模型的方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率近年來(lái)明顯上升，5年生存率〈5%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找有效的檢測(cè)及治療手段是非常重要的，而腫瘤動(dòng)物模型是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制、探索新的治療靶點(diǎn)、新的治療手段及藥物開(kāi)發(fā)的重要工具之一。
[0003]目前，有關(guān)胰腺癌的動(dòng)物研究主要在以嚙齒類動(dòng)物建立的胰腺癌模型上進(jìn)行，但是嚙齒類與人類的物種差異性較大，不能很好地模擬人類疾?。浑S著樹(shù)駒基因組測(cè)序完成，以及部分蛋白組學(xué)的研究提示樹(shù)駒與靈長(zhǎng)類親緣關(guān)系最為接近，這為樹(shù)駒作為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在人類重大疾病研究領(lǐng)域部分替代非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物提供了重要依據(jù)。
[0004]現(xiàn)有的胰腺癌動(dòng)物模型主要包括:基因工程鼠模型、裸鼠移植瘤模型、化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)模型等；這些模型存在一定的缺陷性:不能很好地模擬人類疾病的發(fā)病機(jī)理、誘發(fā)周期長(zhǎng)、誘發(fā)率低等。近年來(lái)，慢病毒技術(shù)由于具有感染物種局限性小、分裂期和靜止期細(xì)胞均可有效感染、轉(zhuǎn)移的DNA片段大、目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在基因過(guò)表達(dá)和沉默中獲得了廣泛應(yīng)用，包括在體外細(xì)胞水平和體內(nèi)感染等。
[0005]本發(fā)明將采用慢病毒技術(shù)表達(dá)特定的癌基因同時(shí)沉默抑癌基因，誘導(dǎo)樹(shù)駒胰腺癌模型。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明相同的公開(kāi)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有胰腺癌模型的不足，提供一種以與人類親緣關(guān)系更近的動(dòng)物——樹(shù)駒，建立誘導(dǎo)周期短、誘發(fā)率高且穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單方便的胰腺癌動(dòng)物模型的方法。
[0007]本發(fā)明的建立胰腺癌模型的方法，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)人類胰腺癌中變異率最高的癌基因和抑癌基因，構(gòu)建過(guò)表達(dá)一個(gè)癌基因、同時(shí)敲降兩個(gè)抑癌基因的慢病毒，在胰腺頭部原位注射此慢病毒，以誘導(dǎo)胰腺癌的發(fā)生。
[0008]所述的同一個(gè)慢病毒載體中過(guò)表達(dá)人類胰腺癌中變異率最高的癌基因?yàn)镵ras，同時(shí)敲降抑癌基因?yàn)門(mén)P53和⑶KN2A。
[0009]所述的以與人類親緣關(guān)系更近的樹(shù)駒為對(duì)象，將慢病毒原位注射到樹(shù)駒胰腺頭部以誘導(dǎo)胰腺癌發(fā)生。
[0010]本發(fā)明的建立胰腺癌模型的方法，具體包括以下步驟:
[0011](I)慢病毒載體的構(gòu)建
[0012]根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中人類胰腺癌變異率最高的癌基因Kras和抑癌基因TP53和⑶KN2A，以pTomo空載體為出發(fā)質(zhì)粒，通過(guò)一系列常規(guī)的酶切連接在CMV啟動(dòng)子后面引入KrasG12D以過(guò)表達(dá)Kras G12D,然后用自帶Hl啟動(dòng)子的shRNA敲降TP53和CDKN2A ；
[0013](2)病毒包裝、滴度測(cè)定及體外驗(yàn)證
[0014]將構(gòu)建好的慢病毒載體和包裝質(zhì)粒pCMV8.l、pMD2.G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)更換新的完全培養(yǎng)基(含10% FBS, I % penicillin/Streptomycin)，分別在48h、72h收集病毒上清，0.45um過(guò)濾除去細(xì)胞碎片后，用25000rpm、4°C離心2.5h濃縮病毒，PBS溶解；用QPCR檢測(cè)病毒滴度，滴度值達(dá)到1.5xl(T12;用病毒體外感染樹(shù)駒原代肝臟細(xì)胞96h后，提取RNA，QPCR檢測(cè)TP53和CDKN2A的敲降效果；
[0015]⑶病毒注射
[0016]選取野生馴養(yǎng)或者人工繁殖的Fl成年樹(shù)駒，用氯胺酮麻醉后，用膠帶將樹(shù)駒仰面固定在消毒泡沫板上，剃毛后用75%酒精對(duì)腹部進(jìn)行消毒，無(wú)菌剪刀在距離胸骨1-1.5cm的位置剪開(kāi)腹部，創(chuàng)口 1cm，用無(wú)菌鑷子找到胰腺，確認(rèn)胰腺頭部，用微量注射器原位注射含0.4%的 trypan blue 的病毒 20ul ；
[0017](4)樹(shù)駒的監(jiān)測(cè)和病理鑒定
[0018]注射病毒后實(shí)時(shí)監(jiān)控樹(shù)駒的狀態(tài)，注射后2周時(shí)樹(shù)駒開(kāi)始發(fā)病，解剖后手術(shù)剝?nèi)∫认倌[瘤組織，胰腺腫瘤組織液氮冷凍后-80°C保存，其余組織按常規(guī)組織病理檢測(cè)方法進(jìn)行固定、脫水、包埋，H&E染色檢測(cè)組織病理特征及腫瘤所屬類型，確定慢病毒誘導(dǎo)的樹(shù)駒胰腺癌模型屬于胰腺導(dǎo)管腺癌。
[0019]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
[0020]1、利用親緣關(guān)系與人類更近的樹(shù)駒，建立了胰腺癌模型的方法。相對(duì)于嚙齒類的動(dòng)物模型，樹(shù)駒胰腺癌模型應(yīng)能更好的模擬人類胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。
[0021]2、本發(fā)明方法快速高效，注射病毒后2周即能誘發(fā)胰腺癌，周期短，且誘發(fā)成功率達(dá)到85%。
[0022]3、構(gòu)建的慢病毒載體中過(guò)表達(dá)的癌基因Kras，敲低的抑癌基因?yàn)門(mén)P53和⑶KN2A，這三個(gè)基因都是人類胰腺癌中變異率最高的基因。因此，本發(fā)明建立的樹(shù)駒胰腺癌模型能很好的模擬人類胰腺癌的遺傳機(jī)理，該模型在胰腺癌基礎(chǔ)研究及抗腫瘤藥物的測(cè)試上具有很大的應(yīng)用潛力。
[0023]4、本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單快捷，且對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高，只需要普通的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，簡(jiǎn)易的操作臺(tái)，普通的剪刀、鑷子、微量注射器即能完成實(shí)驗(yàn)，因此該方法極易廣泛推廣應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
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[0024]圖1是TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中人類胰腺癌樣本中突變率最高的基因及其突變率；
[0025]圖2是本發(fā)明構(gòu)建的慢病毒載體示意圖，在同一個(gè)慢病毒載體中過(guò)表達(dá)癌基因Kras，敲降抑癌基因TP53和CDKN2A ；
[0026]圖3是慢病毒載體中兩個(gè)shRNA在樹(shù)駒細(xì)胞中的敲降效率檢測(cè)，其中TP53敲降率達(dá)到97%，CDKN2A敲降率達(dá)到77% ；
[0027]圖4是樹(shù)駒發(fā)病后的解剖示意圖，如圖中箭頭所指，能夠看到樹(shù)駒胰腺上有明顯的腫瘤，腫瘤大小達(dá)到1.5cm ；
[0028]圖5是注射病毒后樹(shù)駒的生存曲線，從圖中看到樹(shù)駒的發(fā)病時(shí)間集中在2-3周之間；
[0029]圖6是本發(fā)明所誘導(dǎo)的樹(shù)駒胰腺癌的H&E染色，其病理特征包括:具有分化程度不同的導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的腺體，伴有豐富的纖維間質(zhì)(B-D);細(xì)胞形狀多樣化，大小不一，部分細(xì)胞變大，且細(xì)胞胞質(zhì)呈透明狀，也會(huì)有部分嗜酸性細(xì)胞(E-F);細(xì)胞核表現(xiàn)出多形性，染色較深，且核仁較顯著，部分細(xì)胞的細(xì)胞核位于細(xì)胞基底，失去極性(G-1)。
【具體實(shí)施方式】