一種輔酶再生系統(tǒng)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種輔酶再生系統(tǒng)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 相較于傳統(tǒng)的化學(xué)催化，生物催化因其酶催化反應(yīng)的高度的化學(xué)選擇性，區(qū)域選 擇性和立體選擇性等優(yōu)勢而備受關(guān)注和研究。其中由于氧化還原酶的高效性和特異性等， 它們在生物合成中占據(jù)相當重要的地位。氧化還原酶能選擇性的催化含羰基，醛類及酮類 化合物。氧化還原酶作為催化劑制備手性化合物，合成產(chǎn)物的同時會消耗掉一定量的輔酶。 例如：黎舒婷等用三甲基丙酮酸制備L-叔亮氨酸，合成中使用亮氨酸酶與甲酸脫氫酶偶聯(lián) 體系，甲酸脫氫酶可以是輔酶I再生，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率可以達到82%。
[0003] 不像其它的酶類，在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，輔酶與底物的關(guān)系只是化學(xué)計量的關(guān)系。輔 酶是一種消耗性的化合物，不像氧化還原酶一樣可以重復(fù)利用，在反應(yīng)中作為氫的供體，反 應(yīng)結(jié)束后輔酶以氧化態(tài)形式存在。而這些輔酶往往比所制備的產(chǎn)品的價格還要昂貴，穩(wěn)定 性比較差，難以重復(fù)利用，導(dǎo)致了工業(yè)化生產(chǎn)中反應(yīng)成本的高昂，從而限制了氧化還原酶的 使用。在工業(yè)化生產(chǎn)中，不可能投加大量的輔酶，所以高效的輔酶再生系統(tǒng)的構(gòu)建和輔酶的 反復(fù)使用是當下必須解決的問題。
[0004]因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種簡單、高效的輔酶再生技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種輔酶再生系統(tǒng)。
[0006] 本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007]-種輔酶再生系統(tǒng)，包括甲酸脫氫酶（formatedehydrogenase，F(xiàn)DH)、亮氨酸脫氫 酶（leucinedehydrogenase，LDH)和甲酸銨。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述的輔酶再生系統(tǒng)還包括NAD+和/或NADH。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述的輔酶再生系統(tǒng)還包括磷酸吡哆醛。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述的輔酶再生系統(tǒng)中的甲酸脫氫酶和亮氨酸脫氫酶 來自基因工程菌發(fā)酵液，并且所述基因工程菌同時表達甲酸脫氫酶和亮氨酸脫氫酶。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述基因工程菌為同時表達甲酸脫氫酶和亮氨酸脫氫 酶的E.coliBL21(DE3)菌株。
[0012] 本發(fā)明的另一方面是提供一種輔酶再生系統(tǒng)的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0013] (1)甲酸脫氫酶和亮氨酸脫氫酶的異源表達
[0014] 構(gòu)建同時表達FDH和LDH的基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵制得含F(xiàn)DH和LDH的酶液；
[0015] (2)配制輔酶再生系統(tǒng)
[0016] 在緩沖液中配制輔酶再生系統(tǒng)，所述輔酶再生系統(tǒng)包括：所述含F(xiàn)DH和LDH的酶 液、甲酸銨、NAD+、和磷酸吡哆醛。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，其中步驟（1)中包括以下步驟：
[0018] (a)構(gòu)建FDH載體
[0019] 將FDH基因連入使用核酸內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切的pET28a載體，構(gòu)建得到 重組表達FDH的質(zhì)粒pFDH-pET28a;
[0020] (b)構(gòu)建LDH載體
[0021] 將LDH基因連入使用核酸內(nèi)切酶XhoI和NdeI雙酶切的pET21a載體，構(gòu)建得到 重組表達質(zhì)粒pLDH-pET21a;
[0022] (c)構(gòu)建同時表達FDH和LDH的基因工程菌
[0023]將質(zhì)粒pFDH-pET28a和質(zhì)粒pLDH-pET21a共轉(zhuǎn)入E.coliBL21 (DE3)，得到共表達 FDH與LDH的菌株E.coliBL21-FDH/LDH。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，該方法還包括以下步驟：
[0025] (d)發(fā)酵所述菌株E.coliBL21-FDH/LDH，制備所述含F(xiàn)DH和LDH的酶液
[0026] 將共表達菌株E.coliBL21-FDH/LDH在含Amp和Kan的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加 入IPTG至終濃度為0. 01~0. 05mmol/L，16~27°C誘導(dǎo)表達12~20h，發(fā)酵液經(jīng)菌體破壁 后離心取上清即得所述FDH/LDH共表達酶液。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，其中步驟（a)中以假絲酵母總DNA為模板，分別以上下 游引物進行PCR擴增，從而獲得所述FDH基因，其中：
[0028]上游引物為 5 ' -AAACATATGAAAATCGITCTCGITITGTACTCC-3 '，其中，劃線處為NdeI 酶切位點；下游引物為5'-AAACTCGAGTGCGACCTTTTTGTCATTAC-3'，其中，劃線處為Xhol酶切 位點。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，其中加入IPTG至終濃度為0.02mmol/L，誘導(dǎo)溫度為 22°C，誘導(dǎo)表達時間為16h，發(fā)酵液經(jīng)菌體破壁后離心取上清即得所述FDH/LDH共表達酶 液。
[0030] 本發(fā)明的優(yōu)點是：本發(fā)明的輔酶再生系統(tǒng)，輔酶再生效率高，制備方法簡單方便， 極大地降低了輔酶反應(yīng)的成本，適用于大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用。
【附圖說明】
[0031] 圖1顯示了構(gòu)建質(zhì)粒pFDH-pET28a的示意圖；
[0032] 圖2顯示了pTD_pET28a的酶切驗證圖，泳道1TD的PCR擴增產(chǎn)物，泳道 2pTD-pET28a重組質(zhì)粒酶切驗證；
[0033] 圖3顯示了pFDH-pET28a的酶切驗證圖，泳道1FDH的PCR擴增產(chǎn)物，泳道 2pFDH-pET28a重組質(zhì)粒酶切驗證；
[0034] 圖4顯示了pLDH_pET21a的酶切驗證圖，泳道lpLDH_pET21a重組質(zhì)粒酶切驗證， 泳道2酶切獲得的LDH片段。
【具體實施方式】
[0035] 以下實施例是對本發(fā)明的詳細說明。應(yīng)當理解，以下所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施 例，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對本發(fā)明進行修改和等同替換均應(yīng)涵蓋在本 發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0036]在下文中列出本發(fā)明所用的實驗原料。
[0037] 表1實驗質(zhì)粒
[0038]
[0041] 表3實驗中所用到的PCR引物
[0042]
[0043] 表4實驗試劑
[0044]
[0045] 培養(yǎng)基
[0046] LB液體培養(yǎng)基/g?L1:蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，pH7. 0。
[0047]LB固體培養(yǎng)基/g?LS蛋白胨10,酵母提取物5,氯化鈉10,瓊脂條20,pH7. 0。
[0048] 主要溶液和緩沖液
[0049] ⑴質(zhì)粒抽提相關(guān)溶液：
[0050]SolutionI:0? 2973g葡萄糖，0? 091gTris，0? 112gEDTA定容至 30mL。
[0051] SolutionII(新鮮配置）：0?2mol/L NaOH，1% SDS〇
[0052]SolutionIII:44. 163g乙酸鉀，17. 25mL冰醋酸定容至 150mL。
[0053] ⑵5〇XTAE(電泳緩沖液）（/L)
[0054] 242gTris57.lmL醋酸，lOOmLEDTA(0. 05mol/L) 〇
[0055] 實施例1 :PCR擴增目的基因
[0056] (l)PCR擴增引物
[0057] 根據(jù)甲酸脫氫酶（FDH)蘇氨酸脫氨酶（TD)基因序列（Genbanknumber: XM_001525495和AAB18593)及其前后序列設(shè)計引物。經(jīng)過篩選驗證，最佳的甲酸脫氫酶 (FDH)上游引物為 5' -AAACATATGAAAATCGTTCTCGTTTTGTACTCC-3' (劃線處為Ndel酶切位 點）；下游引物為 5' -AAACTCGAGTGCGACCTTTTTGTCATTAC-3' (劃線處為Xhol酶切位點）。 根據(jù)蘇氨酸脫氨酶的基因序列（AAB18593)設(shè)計上下游引物，經(jīng)過篩選驗證，最佳的上游引 物為5' -AAAAAGCTTGTTAGCAGCCGGATCTCAG-3?(劃線處為Hindlll酶切位點）；下游引物為 5' -AAACATATGGTATTAAAACAAATTCTTC-3' (劃線處為Ndel酶切位點）。
[0058] 以假絲酵母和大腸桿菌總DNA為模板，分別以上下游引物擴增得到FDH和TD基因 片段。
[0059] (2)PCR反應(yīng)體系
[0060]PrimeSTARHSDNA聚合酶PCR反應(yīng)體系如表5所示。
[0061] 表5PCR反應(yīng)體系
[0062]
[0063] (3)PCR反應(yīng)程序
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