一種檢測簡單異尖線蟲和華支睪吸蟲囊蚴的雙重pcr擴增試劑盒及其擴增引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種寄生蟲檢測試劑盒,特別涉及一種檢測簡單異尖線蟲和華支睪吸 蟲囊蝴的雙重PCR擴增試劑盒及其擴增引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著吃海鮮、生魚片等飲食時尚的興起和漁業(yè)、旅游業(yè)的發(fā)展,食源性寄生蟲病已 成為我國的新"富貴病",我國城鎮(zhèn)居民特別是沿海經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)的感染人數(shù)呈上升勢頭。 據(jù)調(diào)查,由于市場開放,魚類、肉類等食品供應渠道增加,城鄉(xiāng)食品衛(wèi)生監(jiān)督難以跟上,疫區(qū) 魚類、活畜及畜產(chǎn)品大量流入非疫區(qū),加上風行的生、冷獵奇的飲食方式,寄生蟲病可能出 現(xiàn)在生食生鮮水產(chǎn)品的人群中。因此有必要開展對生鮮水產(chǎn)品中主要食源性寄生蟲感染現(xiàn) 狀調(diào)查,并研究寄生蟲快速、準確、靈敏的病原鑒別方法,用于規(guī)范水產(chǎn)品生產(chǎn)和流通,保障 居民餐桌上的魚蝦肉食品安全健康。
[0003] 華支睪吸蟲囊蝴主要存在于淡水魚種,簡單異尖線蟲存在于海水魚種,生鮮淡海 水魚均可能加工成魚肉,淡海魚種無法區(qū)分,此時直接運用生食,且加工刀具存在互相交叉 污染的可能,魚肉中存在同時感染這兩種致病蟲種的可能。目前,華支睪吸蟲的鑒定方法還 沒有統(tǒng)一的標準,目前對華支睪吸蟲囊蝴的診斷依賴于顯微鏡檢查。眾所周知,顯微鏡檢查 耗費時間長,檢查效率低,對檢查者臨床工作經(jīng)驗要求較高,而且對于與華支睪吸蟲親緣關(guān) 系相近的囊蝴,蟲卵形態(tài)相似,普通光鏡無法區(qū)分,使用這種方法往往會出現(xiàn)誤判。免疫診 斷法雖然較顯微鏡檢查法效率高,但也常常為靈敏度和特異性所局限。此外,簡單異尖線蟲 和華支睪吸蟲囊蝴一般都是分開檢測的,耗時長,檢測成本高。多重PCR可以同時檢測兩種 病原生物,但傳統(tǒng)的多重PCR體系中,由于存在多對引物,引物之間的干擾以及引物與模板 的錯配而造成靈敏度下降與非特異性擴增反應增加等問題,制約多重PCR技術(shù)的發(fā)展。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測簡單異尖線蟲和華支睪吸蟲囊蝴的雙重PCR擴 增試劑盒,不但保持了較高的特異性和敏感性,而且更加方便、快捷和經(jīng)濟,一次反應可檢 測兩個基因。
[0005] 本發(fā)明還提供了上述檢測簡單異尖線蟲和華支睪吸蟲囊蝴的雙重PCR擴增引物。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0007] -種檢測簡單異尖線蟲和華支睪吸蟲囊蝴的雙重PCR擴增試劑盒,包括PCR擴增 反應液,所述 PCR 擴增反應液包括:Tris-HCl 10mmol/L,KCl 50mmol/L,MgCl2 1.5mmol/L, dNTPs 0. 64mmol/L,簡單異尖線蟲正向擴增引物0. 32 y mol/L,簡單異尖線蟲反向擴增引 物0. 32 ymol/L,華支睪吸蟲囊蝴正向擴增引物0. 32 ymol/L,華支睪吸蟲囊蝴反向擴增引 物0. 32 y mol/L,簡單異尖線蟲DNA模板10-24ng/ y L,華支睪吸蟲囊蝴DNA模板10-24ng/ yL,Taq 酶 lU/yL。
[0008] 本發(fā)明以華支睪吸蟲囊蝴和簡單異尖線蟲的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(18S rRNA,ITS-1,5. 8S rRNA,ITS-2, 28S rRNA)序列為目標,專門設計了針對性的兩對特異性引 物,引物之間的干擾小,非特異性擴增反應少,保證了檢測的靈敏度與特異性,既提高檢測 速度降又降低了檢驗成本。進一步的設計了檢測試劑盒,檢測結(jié)果特異,結(jié)果易判斷,靈敏 度高,特異性強,檢測快速、準確、經(jīng)濟,為華支睪吸蟲和簡單異尖線蟲同時感染的診治和預 防提供有效的技術(shù)手段。
[0009] 作為優(yōu)選,所述簡單異尖線蟲正向擴增引物序列為: 5'-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3'(SEQ ID NO. 1)。
[0010] 作為優(yōu)選,所述簡單異尖線蟲反向擴增引物序列為: 5'-CCCTACGAAATGGCATACTTG-3'(SEQ ID N0. 2)。
[0011] 作為優(yōu)選,所述華支睪吸蟲囊蝴正向擴增引物序列為: 5'-ATGCTCTCGGTATGCTCGCTT-3'(SEQ ID N0. 3)。
[0012] 作為優(yōu)選,所述華支睪吸蟲囊蝴反向擴增引物序列為: 5'-GTCGTACCCGGGATAAGGCA-3'(SEQ ID N0. 4)。
[0013] 作為優(yōu)選,所述Tris-HCl的pH為8. 3。
[0014] -種檢測簡單異尖線蟲和華支睪吸蟲囊蝴的雙重PCR擴增引物,包括簡單 異尖線蟲擴增引物和華支睪吸蟲囊蝴擴增引物,所述簡單異尖線蟲擴增引物包括簡 單異尖線蟲正向擴增引物和簡單異尖線蟲反向擴增引物,所述簡單異尖線蟲正向 擴增引物序列為:5' -CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3',所述簡單異尖線蟲反向擴增引 物序列為:5' -CCCTACGAAATGGCATACTTG-3',所述華支睪吸蟲囊蝴正向擴增引物序 列為:5' -ATGCTCTCGGTATGCTCGCTT-3',所述華支睪吸蟲囊蝴反向擴增引物序列為: 5' -GTCGTACCCGGGATAAGGCA-3'。采用本發(fā)明設計的特異性擴增引物,引物之間的干擾小,非 特異性擴增反應少,保證了檢測的靈敏度與特異性,既提高檢測速度降又降低了檢驗成本。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是:
[0016] 1、引物之間的干擾小,非特異性擴增反應少,保證了檢測的靈敏度與特異性,既提 高檢測速度降又降低了檢驗成本。
[0017] 2、與常規(guī)PCR相比,本發(fā)明的雙重PCR不但保持了較高的特異性和敏感性,而且更 加方便、快捷和經(jīng)濟,一次反應可檢測兩個基因。
【附圖說明】
[0018] 圖1是簡單異尖線蟲單重PCR結(jié)果,圖中:M :DL2000DNA Marker ;1 :陰性對照;2 : 簡單異尖線蟲DNA ;3-5 :鯖魚魚肉DNA。
[0019] 圖2是華支睪吸蟲囊蝴單重PCR結(jié)果,圖中:M :DL2000DNA Marker ;1 :陰性對照; 2 :華支睪吸蟲囊蝴DNA ;3-4 :麥穗魚魚肉DNA。
[0020] 圖3是雙重PCR檢測結(jié)果,圖中:M :DL2000DNA Marker ; 1 :陰性對照;2 :簡單異尖 線蟲和華支睪吸蟲囊蝴DNA ;3-5 :偽地新線蟲DNA、刺激隱核蟲和棘顎口線蟲DNA ;6-7 :鯖 魚魚肉DNA和麥穗魚魚肉DNA。
[0021] 圖4是敏感性試驗結(jié)果,圖中:M :DL2000DNA Marker ;1 :陰性對照;2 :50ng/ y L 混合蟲 DNA ;3 :5ng/ y L 混合蟲 DNA ;4 :500pg/ y L 混合蟲 DNA ;5 :50pg/ y L 混合蟲 DNA ;6 : 5pg/ y L 混合蟲 DNA ;7 :0? 5pg/ y L 混合蟲 DNA ;8 :0? 05pg/ y L 混合蟲 DNA。
【具體實施方式】
[0022] 下面通過具體實施例,并結(jié)合附圖,對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。
[0023] 本發(fā)明中,若非特指,所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實施例中的方法,如無特別說明,均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0024] 本發(fā)明實施如下:
[0025] 1、材料與方法
[0026] 1. 1 材料:
[0027] 囊蝴和華支睪吸蟲DNA陽性對照來源:2013年5月底采集舟山市場上銷售的麥穗 魚,用消化法從魚肉組織中分離獲得華支睪吸蟲囊蝴。簡單異尖線蟲、偽地新線蟲、刺激隱 核蟲和棘顎口線蟲由舟山出入境檢驗檢疫局提供。
[0028] dNTPs、Taq酶均購自大連寶生物公司。
[0029] 1. 2 方法
[0030] 1. 2. 1囊蝴的分離
[0031] 將麥穗魚用清水洗凈,去除魚頭、魚尾、魚鰭、魚刺及內(nèi)臟,將魚肉用絞肉機加工 成肉泥,放入玻璃杯。按每克魚肉加入10mL人工胃液(鹽酸濃度為8mL/L,胃蛋白酶濃 度8g/L,氯化鈉濃度為9g/L),37°C孵箱作用2h,將消化完全的魚肉消化液經(jīng)80目分離篩 過濾集中于2L的分液漏斗中沉淀0. 5h,放出約300mL的消化液至500mL的燒杯中,沉淀 10-30min后,棄去上面的濁液,用清水反復清洗至液體清亮,隨后將含蟲體的液體轉(zhuǎn)移至 15mL尖底離心管內(nèi),沉淀lmin后將含囊蝴的上清液體吸至另一新管內(nèi),反復沉淀幾次,顯 微鏡下檢查囊蝴純凈度。將剩余的囊蝴保存在Alsever's溶液(Alsever's Solution,市 售)中,置于4°C冰箱備用。
[0032] 1.2. 2囊蝴的形態(tài)學和DNA提取
[0033] 取少量上述收集到的囊蝴置于顯微鏡下觀察,并對其進行了形態(tài)學鑒定。隨后按 照Takara universal Genomic DNA Extraction kit (市售,購自大連寶生物公司)說明書 中提供的方法提取囊蝴的基因組DNA。
[0034] 簡單異尖線蟲基因組 DNA 按照 Takara universal Genomic DNA Extraction kit 說明書中提供的方法進行DNA的提取,作為對照的偽地新線蟲、刺激隱核蟲和棘顎口線蟲 基因組DNA也參照Takara universal Genomic DNA Extraction kit說明書中提供的方法 進行DNA的提取。
[0035] 上述提取到基因組DNA的測定核酸濃度后保存于_20°C備用。
[0036] 1. 2. 3引物設計與合成
[0037] 參考Genbank上公布的華支睪吸蟲囊蝴和簡單異尖線蟲的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū) (18S rRNA, ITS-1, 5. 8S rRNA, ITS-2, 28S rRNA)序列,應用 MegAlign 軟件將幾種線蟲的序 列進行比對,分析內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列中的各種線蟲相互之間的相同區(qū)域和不同區(qū)域,從而進行 特異性引物的設計,最后由生工生物(上海)有限公司合成。
[0038] 在PCR引物設計中除了按常規(guī)PCR引物設計通用準則外,要求引物與靶基因具有 高度的特異性,引物之間彼此無同源性,不會出現(xiàn)交叉錯配、引物二聚體等。設計的擴增片