一種快速檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的方法及引物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性基因型G143A菌株的方法及引物組合物；可用于灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性群體發(fā)展的動態(tài)監(jiān)測與抗性風(fēng)險評估，為作物灰霉病的抗性預(yù)警、抗性治理及合理用藥提供科學(xué)指導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
[0002]由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病，是一種重要的世界性病害。該病害寄主廣泛，可侵染235余種植物，在我國各地均有發(fā)生，它不僅侵染果實(shí)，也侵染莖、葉、花，還會引起大棚蔬菜上的果實(shí)腐爛，可造成產(chǎn)量損失20-30%，局部減產(chǎn)達(dá)到70%以上，嚴(yán)重時甚至是絕收，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于缺少有效的抗灰霉病品種，灰葡萄孢菌寄主?；匀?、產(chǎn)孢量大、傳播速度快、極易產(chǎn)生遺傳變異性，因此，目前灰霉病的防治仍以化學(xué)防治為主。該方法見效快，防效高，操作簡便，能有效的減少灰霉病的發(fā)生與發(fā)展，降低經(jīng)濟(jì)損失，成為防控該病害的關(guān)鍵措施之一。但是隨著單一殺菌劑使用年限的增長、藥劑使用不規(guī)范及藥劑劑量的增大，田間抗性菌株也不斷出現(xiàn)，且呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢。根據(jù)國內(nèi)外研究報道，灰葡萄孢菌已對很多常用殺菌劑產(chǎn)生了抗性，如苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、苯胺基嘧啶類、N-苯基氨基甲酸酯類、甲氧基丙烯酸酯類(QoIs)和琥珀酸脫氫酶類(SDHIs)等殺菌劑。隨著灰霉病抗性問題日益突出，灰霉病的抗藥性監(jiān)測對抗性流行性預(yù)警及田間合理用藥具有重要指導(dǎo)作用。檢測或監(jiān)測灰葡萄孢菌對殺菌劑的抗藥性，通常是通過單孢分離菌株后采用菌絲生長法、孢子萌發(fā)法及微孔板法，然而這些傳統(tǒng)的檢測方法檢測周期較長，從分離到鑒定長達(dá)I周，檢測效率低，且在病原菌培養(yǎng)過程中存在雜菌污染，給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來誤差；同時，還需投入大量的人力資源，增加檢測成本。
[0003]近年來，隨著核酸相關(guān)分子檢測技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)為植物病原菌的抗藥性檢測提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，但是檢測需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器及繁瑣的電泳過程，檢測時間長，檢測成本高昂等，不能滿足經(jīng)濟(jì)高效檢測的需求，并且在鑒定過程中還需要接觸大量有毒有害試劑，對實(shí)驗(yàn)操作人員存在較大的安全隱患。因此，開發(fā)對植物病原菌抗藥性檢測的新技術(shù)已迫在眉睫。
[0004]環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增反應(yīng)(LAMP)是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，廣泛應(yīng)用于動物、植物等疾病的基因診斷。該技術(shù)原理是:利用一套(4種)特異性引物，在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60?65°C范圍30-80min內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA的同時伴隨有副產(chǎn)物——白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。羥基萘酚藍(lán)(HNB)是一種金屬離子指示劑，根據(jù)反應(yīng)液中鎂離子的變化而呈現(xiàn)出不同的顏色，陰性(沒有擴(kuò)增出產(chǎn)物)時為紫色，陽性(有產(chǎn)物擴(kuò)增)時為天藍(lán)色。LAMP方法的最大特點(diǎn)就是實(shí)現(xiàn)恒溫擴(kuò)增，不需要循環(huán)儀、凝膠成像系統(tǒng)等昂貴的儀器；擴(kuò)增反應(yīng)極快，一般在I小時內(nèi)完成；擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，通過肉眼即可判定結(jié)果，不需要繁瑣的電泳過程；靈敏度高、特異性強(qiáng)；操作簡便、快捷，極適于病原突變基因型的快速鑒定及檢測。
[0005]已有研究表明，細(xì)胞色素b(cyt b)第143位是大多數(shù)病原體Qo抑制劑的一個結(jié)合位點(diǎn)。由于灰葡萄孢菌cty b基因存在結(jié)構(gòu)多樣性，在第143/144位氨基酸之間有內(nèi)含子插入，也有無內(nèi)含子插入的結(jié)構(gòu)。其中，敏感菌株在這兩種結(jié)構(gòu)中均存在，抗性菌株僅出現(xiàn)在第143/144位氨基酸之間均沒有內(nèi)含子插入的結(jié)構(gòu)中。在灰葡萄孢菌中，其對QoI類殺菌劑的抗性主要是通過對病原菌進(jìn)行單基因突變，將cyt b基因第143位甘氨酸(G)變?yōu)楸彼?A)后，使得對QoI類殺菌劑表現(xiàn)出高抗。目前，這也是在灰葡萄孢菌中報道的唯一的QoI類殺菌劑抗性基因型。
[0006]本發(fā)明中，依據(jù)灰葡萄孢菌cyt b基因第143位氨基酸突變基因型(GGT — GCT)，基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)建立了灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的快速分子檢測技術(shù)。該檢測技術(shù)具有簡單、快速、成本低，靈敏性高等特點(diǎn)，能大大提高檢測效率，對灰霉病的抗藥性檢測、抗藥性流行預(yù)警具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。然而，經(jīng)檢索目前國內(nèi)外尚未有灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP快速分子檢測的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明目的:針對已有灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性鑒定方法中存在費(fèi)時、費(fèi)力、成本高、準(zhǔn)確性低等缺點(diǎn)及PCR檢測技術(shù)需要昂貴的熱循環(huán)儀器和繁瑣的電泳操作過程，無法達(dá)到快速檢測的需要。本發(fā)明的目的是提供一種灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測引物組合物及基于LAMP技術(shù)提供一種快速分子檢測方法，該方法具有檢測周期短、準(zhǔn)確性和靈敏度高、肉眼可以直接觀察檢測結(jié)果等諸多優(yōu)點(diǎn)。
[0008]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0009]一種用于檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測引物組合物:有正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3組成；各引物序列具體如下:
[0010]FIP:5’ -CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’ ；
[0011 ] BIP:5’ -TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTTAATGGCA-3’ ；
[0012]F3:5’ -GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’ ；
[0013]B3:5 ’ -GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
[0014]所述的LAMP檢測引物組合物在檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性中的應(yīng)用。
[0015]一種檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測試劑盒:包括ImL檢測溶液，所述的檢測溶液包括:1.2μΜ正向內(nèi)引物FIP，1.2μΜ反向內(nèi)引物ΒΙΡ，0.3μΜ正向外引物 F3，0.3 μΜ 反向外引物 B3，60 yL 1XThermoPol Buffer, 1.5mM MgCl2,1.0mM dNTPs，
0.2M甜菜堿，1.5mM羥基溴酚藍(lán)(HNB)，160U Bst DNA聚合酶，加入無菌超純水制備得到；其中，各引物序列如下:
[0016]FIP:5’ -CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’ ；
[0017]BIP:5’ -TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’ ；
[0018]F3:5’ -GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’ ；
[0019]B3:5 ’ -GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
[0020]所述的灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測試劑盒在檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性中的應(yīng)用。
[0021]一種檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法:包括提取待檢灰葡萄孢菌的DNA，以提取的DNA為模板，利用LAMP檢測引物組合物或LAMP檢測試劑盒進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下觀察結(jié)果，若存在梯狀條帶，則證明所檢測的灰葡萄孢菌為QoI類殺菌劑抗性菌株；若無梯狀條帶，則證明所檢測灰葡萄孢菌為QoI類殺菌劑敏感菌株；或觀察LAMP反應(yīng)溶液顏色變化，若為天藍(lán)色，判定為QoI類殺菌劑抗性菌株；若為紫色，判定為QoI類殺菌劑敏感菌株。
[0022]所述的檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法:提取待檢灰葡萄孢菌的DNA，取I μ L DNA溶液，加入9 μ L試劑盒中的檢測溶液進(jìn)行LAMP，LAMP反應(yīng)參數(shù)為59-610C 60min，80°C 1min0
[0023]本發(fā)明的檢測灰葡萄孢菌對QoI類殺菌劑抗性的LAMP檢測方法，包括提取待檢灰葡萄孢菌的DNA，以提取的DNA為模板，利用所述的LAMP引物組合物進(jìn)行LAMP ;擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下觀察結(jié)果(羥基溴酚藍(lán)不會影響電泳結(jié)果)，若存在梯狀條帶，所檢測的灰葡萄孢菌為QoI類殺菌劑抗性菌株；若無梯狀條帶，則證明所檢測灰葡萄孢菌為QoI類殺菌劑敏感菌株。羥基溴酚藍(lán)(HNB)是Mg2+的滴定劑，其顏色隨溶液pH變化而改變，因此可以通過監(jiān)測LAMP反應(yīng)體系中Mg2+濃度的變化及溶液pH而起到顏色指示劑的作用。反應(yīng)前將HNB加入到反應(yīng)液中，反應(yīng)體系呈紫色，反應(yīng)過程中Mg2+與LAMP