一種以唾液為檢測(cè)樣本的肝癌診斷試劑及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種診斷肝癌的試劑及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是肝癌大國(guó)，肝癌的發(fā)病率和死亡率都占了全球的一半以上。肝癌的準(zhǔn)確診 斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 現(xiàn)時(shí)，國(guó)際上通常用來(lái)篩查肝癌的生物標(biāo)志物是血清AFP (甲胎蛋白）。但其敏感 性只有39%至65%，特異性只有76%至94%。由于其檢測(cè)肝癌的敏感性跟特異性不甚理 想，因此美國(guó)的治療指南不推薦血清AFP用于肝癌的診斷。中國(guó)跟歐洲的治療指南都指出， 正常個(gè)體的AFP水平應(yīng)小于20ng/ml，大于400ng/ml則可提示肝癌的診斷。而20至400ng/ ml則是診斷的"灰色地帶"。因此利用AFP篩查肝癌容易導(dǎo)致誤診漏診。
[0004] 除了血液取樣方式，另一種診斷方式是組織取樣診斷。然而，肝組織取樣對(duì)人體破 壞性強(qiáng)，因此，亟須一種沒(méi)有創(chuàng)傷式而準(zhǔn)確的診斷方法。
[0005] 人體唾液腺中存在許多毛細(xì)血管網(wǎng)，因此，唾液是血液循環(huán)的末端產(chǎn)物。血液中存 在的分子物質(zhì)，例如DNA、RNA、蛋白、藥物、病毒等，都能在唾液中找到。因而唾液被認(rèn)為是人 體健康狀態(tài)的一面鏡子，能反映出機(jī)體的各種內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，例如癌癥、感染、系統(tǒng)性疾病等。 美國(guó)的食品及藥物管理局（FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)了利用唾液檢測(cè)藥物濫用、HIV感染、激素水平、 中毒等試劑在市場(chǎng)上應(yīng)用，現(xiàn)已在全美都已經(jīng)得到普及。在臨床中，于唾液中尋找分子標(biāo)記 物是最理想的方法，因?yàn)槭占僖捍嬖诤?jiǎn)單、方便、無(wú)創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、不會(huì)引起患者不安、操作者 易于掌握等優(yōu)點(diǎn)。研究已經(jīng)證實(shí)了唾液中的轉(zhuǎn)錄物、蛋白、代謝物和其他分子物質(zhì)能檢測(cè)出 口腔癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、干燥綜合征等其他口腔或者系統(tǒng)性疾病。體內(nèi)的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，IncRNA)與包括肝癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)病與發(fā)展密切相關(guān)。 研究發(fā)現(xiàn)多種IncRNA在肝癌組織中表達(dá)失調(diào)，組織中表達(dá)失調(diào)的IncRNA可作為生物標(biāo)記 物對(duì)肝癌有較佳的診斷價(jià)值。但唾液IncRNA是否可作為生物標(biāo)記物協(xié)助診斷肝癌，目前尚 無(wú)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種以唾液作為檢測(cè)樣本的檢測(cè)肝癌的試劑和試劑盒。
[0007] 本發(fā)明同時(shí)提供了試劑盒的使用方法。
[0008] 本發(fā)明還提供以唾液作為檢測(cè)樣本的方法。
[0009] 發(fā)明首先提供了一種以唾液作為檢測(cè)樣本的檢測(cè)肝癌的試劑，該試劑為IncRNA H19檢測(cè)試劑，該試劑的檢測(cè)對(duì)象為唾液樣本。
[0010] 發(fā)明同時(shí)提供了 IncRNA H19唾液檢測(cè)試劑在制備檢測(cè)肝癌試劑或試劑盒中的應(yīng) 用。
[0011] 以唾液作為樣本來(lái)進(jìn)行肝癌標(biāo)記物的檢測(cè)，最大的難點(diǎn)在于，需要尋找到能分泌 到唾液中的，且在唾液中能穩(wěn)定存在的標(biāo)記物。盡管目前已有大批的肝癌標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，這 些標(biāo)記物存在于組織樣品或血液樣品中，然而，同樣的標(biāo)記物采用唾液樣本取樣，往往是另 一個(gè)結(jié)果，不能用作肝癌診斷。這很可能是因?yàn)槟鼙环置诘酵僖褐械臉?biāo)記物本身就很少，并 且唾液中存在大量的酶，標(biāo)記物容易降解。因此，以唾液樣本檢測(cè)肝癌，在此前仍未見(jiàn)任何 報(bào)道。
[0012] 而本發(fā)明的一大突破在于，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在肝癌患者中其唾液樣本存在大量的 IncRNA H19。其穩(wěn)定而大量地存在，能被高重現(xiàn)性地檢出。而正常樣本中，該標(biāo)記物表達(dá)水 平非常低。這使得IncRNA H19成為一種良好的唾液樣本標(biāo)記物，對(duì)于肝癌的檢測(cè)或診斷具 有突破性的意義。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步提供給了一種以唾液作為檢測(cè)樣本的檢測(cè)肝癌的試劑盒，其含有蛋 白酶和IncRNA H19檢測(cè)試劑。
[0014] 上述的IncRNA H19檢測(cè)試劑含有檢測(cè)用引物，所述引物的序列如SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2 所示。
[0015] 作為可選的實(shí)施方式所述的蛋白酶選自蛋白酶K。
[0016] 優(yōu)選地，所述的試劑盒還含有酸酚氯仿混合物。并且進(jìn)一步優(yōu)選地，還可含有 DEPC(焦碳酸二乙酯）。
[0017] 可選地，所述的酸酚氯仿混合物為鹽酸-苯酚-氯仿混合物；優(yōu)選地；苯酚與氯仿 的體積比為（4. 5-5. 5) : 1 ;優(yōu)選地，所述的酸酚氯仿混合物pH值為4. 3-4. 7。
[0018] 發(fā)明還提供給了一種檢測(cè)唾液IncRNA H19的方法，包括以下步驟：提取唾液中總 RNA后，進(jìn)行l(wèi)ncRNH19的逆轉(zhuǎn)錄，再通過(guò)qPCR反應(yīng)檢測(cè)IncRNA H19水平。
[0019] 提取唾液IncRNA H19的方法可采用以下步驟：
[0020] S1.取唾液樣本，加入蛋白酶，60_65°C孵育以去除唾液蛋白；
[0021] S2.加入酸酚仿混合物后，10000-12000g離心4-6分鐘，收集上清；
[0022] S3?加入1. 25倍體積的乙醇，再經(jīng)5000-6000g離心20-100秒過(guò)濾離心，棄
[0023] 濾液；
[0024] S4?加入預(yù)熱的 DEPC 水，10000-12000g 離心 20-100 秒，收集 RNA。
[0025] 本發(fā)明的方法可成功提取唾液中的總RNA，最后利用qPCR(定量聚合酶鏈反應(yīng)）技 術(shù)可檢測(cè)出特定的RNA。
[0026] 本發(fā)明首次在唾液中尋找到診斷肝癌敏感特異的生物標(biāo)記物--IncRNA H19。
[0027] 通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，唾液H19在乙肝相關(guān)性肝癌患者中的表達(dá)水平顯著升高。 然后建立預(yù)測(cè)診斷肝癌的R0C曲線推斷，正常個(gè)體的值應(yīng)小于22. 919725。若受檢個(gè)體的 唾液H19的表達(dá)水平大于此值，則受檢個(gè)體判定為肝癌的敏感性為68. 7 %，特異性為87 %。 唾液IncRNA H19在成為協(xié)助篩查乙肝相關(guān)性肝癌的標(biāo)志物方面具有良好的前景，收集唾液 的取樣方式簡(jiǎn)單、方便、無(wú)創(chuàng)、價(jià)廉、不會(huì)引起患者不安、操作者易于掌握、受檢者易于接受， 且準(zhǔn)確率高，對(duì)肝癌的早診早治，降低死亡率，減輕我國(guó)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)具有重大的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為不同肝組織樣本中的H19表達(dá)水平。
[0029] 圖2為不同人群唾液樣本中的H19表達(dá)水平。
[0030] 圖 3 為唾液 H19 檢測(cè)結(jié)果的 R0C(Receiver Operating Characteristic)曲線。
[0031] 圖4為肝癌患者的血清AFP水平。
[0032] 圖5為不同AFP表達(dá)水平患者的唾液H19檢出水平。
[0033] 圖6為H19的qPCR擴(kuò)增曲線（圖6A)和溶解曲線（圖6B)。
[0034] 圖7為IncRNA MALAT1和微小RNA miR-224在肝組織樣本檢測(cè)結(jié)果。
[0035] 圖8為IncRNA MALAT1和微小RNA miR-224在唾液樣本檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，具體實(shí)施例不代表對(duì)本發(fā) 明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明理念所做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
[0037] 實(shí)施例1唾液采集
[0038] 在唾液采集前，研究個(gè)體需禁食、禁飲、禁煙和禁止口腔清潔2h以上。
[0039] 為增加唾液收集量，采用2%檸檬酸溶液濕潤(rùn)無(wú)菌棉簽棉花頭，然后將棉花頭放于 研究個(gè)體舌頭一側(cè)的后側(cè)壁約5s，吐出唾液后，再將棉簽放到另一側(cè)的舌頭后側(cè)壁。如此 反復(fù)收集。唾液收集量需達(dá)5ml以上，收集管使用50ml無(wú)菌無(wú)酶離心管。4°C、3000g離心 15min取上層上清至1. 5ml Eppendoff管，再以4°C、12000g離心10min后再棄沉淀取上清。 標(biāo)本處理后均置-80°C保存。
[0040] 實(shí)施例2唾液總RNA的提取
[0041] 1.將1ml唾液平均分裝在兩支1. 5ml的無(wú)酶EP管上，即每支EP管都盛有500 y 1 的唾液，然后向每只EP管加入蛋白酶K(20mg/ml) 15 y 1，混勻，放于65°C水浴鍋孵育過(guò)夜。 因?yàn)橥僖褐泻休^多的消化酶類(lèi)等蛋白，影響后續(xù)提取唾液RNA的效果，因此此法可去除 唾液蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。
[0042] 2?兩支EP管各加0? 5ml的酸酚氯仿混合物（主要成分為鹽酸、苯酚與氯仿）到上 述唾液混合液中。
[0043] 酸酚氯仿的配置
[0044] 2. 1苯酚與氯仿的比例為：5:1
[0045] 2. 2用濃鹽酸調(diào)pH值，pH值定在4. 5左右，此pH值最利于提取RNA?；靹?。
[0046] 3.加入后手動(dòng)搖勻30到60秒
[0047] 4.室溫下10000g離心5分鐘。離心后中層液體需緊致，否則重新離心。
[0048] 5.收集上清，需謹(jǐn)慎，不能攪動(dòng)下層液相。
[0049] 6.將1. 25倍體積的100%乙醇加到上清液中。例如收集到500 y 1上清，則加 625 yl無(wú)水乙醇。
[0050] 7.將過(guò)濾管放入收集管內(nèi)，將上述混合物加到過(guò)濾管中（過(guò)濾管和收集管市場(chǎng)上 有銷(xiāo)售）。<