一種采用熒光rt-pcr技術(shù)檢測牙鲆tlr8基因表達(dá)的方法
【專利說明】-種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測牙鲆TLR8基因表達(dá)的方法
[0001] 本發(fā)明得到天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（14JCZDJC34200) "遲鈍愛德華氏菌誘 導(dǎo)的牙鲆TLRs家族免疫應(yīng)答機(jī)制研究"的資助。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于檢測牙鲆TLR8基因表達(dá)的特異性引物，更具 體的說是一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測牙鲆TLR8基因表達(dá)的方法。主要用于牙鲆TLR8 基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究和免疫學(xué)功能研究，以及牙鲆早期病原感染的監(jiān)測。
【背景技術(shù)】
[0003] 隨著世界范圍水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，國內(nèi)外水產(chǎn)品貿(mào)易及水產(chǎn)苗種跨區(qū)域交流日 益頻繁，大大增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原傳播的機(jī)會。同時(shí)，由于現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化、高 密度生產(chǎn)方式及漁業(yè)水域環(huán)境的惡化，又常會引發(fā)養(yǎng)殖動物的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體的免疫 系統(tǒng)受到抑制。正是這些因素相互影響，出現(xiàn)了全球性的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物發(fā)病率趨于頻繁、流 行程度日益廣泛、經(jīng)濟(jì)損失極為巨大的局面。運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的技術(shù)支撐， 掌握病害的免疫防御技術(shù)是水產(chǎn)科技急需解決的首要問題，因此，近年來國際上魚類免疫 學(xué)的研究逐漸受到重視。
[0004] 在人類免疫學(xué)研究的歷史舞臺上，細(xì)胞免疫和體液免疫一直是兩個(gè)主角。相比之 下，固有免疫的研究由于缺乏對其相應(yīng)受體的系統(tǒng)認(rèn)識，明顯滯后于獲得性免疫研究的 進(jìn)程。20世紀(jì)90年代，Janeway等有關(guān)"病原體相關(guān)分子模式"以及"模式識別受體"概 念的提出，標(biāo)志著固有免疫研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。魚類雖是低等脊椎動物，但已具 備免疫的基本特性，與哺乳動物一樣，其體內(nèi)也存在2種免疫應(yīng)答類型：固有免疫應(yīng)答和獲 得性免疫應(yīng)答。而相對于哺乳動物來說，魚類的固有免疫研究才剛剛起步。
[0005] Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs)家族是動物識別入侵病原體的主要 "模式識別受體"，可識別幾乎所有病原生物的一些通用結(jié)構(gòu)，是啟動固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。 一般認(rèn)為TLR 1、2、4、5和6主要參與細(xì)菌成分的識別，而TLR3、TLR7和TLR8主要特異地針 對病毒成分，TLR9對這二者均能夠識別。TLR14、21~23在某些魚類中存在，在哺乳動物中 還未發(fā)現(xiàn)。
[0006] 牙鮮及在我國俗稱牙片、偏口、比目魚，是我國北方海水 工廠化養(yǎng)殖的主要名貴魚類品種，同時(shí)也是重要的海水增養(yǎng)殖魚類之一。牙鲆屬于鰈形目， 鲆科，牙鲆屬。牙鲆屬的魚類在南、北美洲東西岸較多，而亞洲沿岸只有牙鲆一種，主要分布 于渤海、黃海、東海、南海以及朝鮮、日本、俄羅斯沿岸海區(qū)。近年來，腹水病、病毒性神經(jīng)壞 死癥等各種病害的爆發(fā)和流行給生產(chǎn)企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了牙鲆養(yǎng)殖產(chǎn) 業(yè)的發(fā)展。腹水病在牙鲆疾病中危害最為嚴(yán)重，該病從苗種到成魚均有發(fā)生，死亡率可達(dá) 50%-80%。由于目前對牙鲆免疫機(jī)理和機(jī)制的了解較少，尚無有效的免疫防治技術(shù)和治療方 法。
[0007] TLRs是宿主免疫的必需分子之一，通過感知病原微生物體，識別病原相關(guān)分子 模式，激活天然免疫系統(tǒng)，TLR8作為TLRs家族的成員，參與魚類免疫調(diào)節(jié)，在一定程度上反 映了魚類的免疫能力，因此可以作為魚類疾病防治中免疫監(jiān)測的指標(biāo)，同時(shí)，揭示牙鲆TLR8 的免疫學(xué)功能及作用機(jī)理，也將為尋找魚類病害防治的新策略提供理論依據(jù)，具有潛在的 應(yīng)用價(jià)值和社會效益。
[0008] 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒 光PCR不僅實(shí)現(xiàn)了常規(guī)PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光PCR技 術(shù)由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可進(jìn)一步提高靈敏度；實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。目前，已 廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。隨著實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的進(jìn)一步開發(fā)，近年 來，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在動物疫病診斷中也得到了廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是公開一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測牙鲆TLR8基因表達(dá)的方法。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下： 設(shè)計(jì)一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測牙鲆TLR8基因表達(dá)的特異性引物，其特征在于包 括符合熒光PCR反應(yīng)特點(diǎn)的特異上下游引物：TLR8-q-F:5'- AGTTTCACCCGCAGATTG -3' ； TLR8-q-R:5'_ CTGGGATGCCTCCTATGT -3' ； 以及作為內(nèi)參基因的牙鲆0 -actin特異上下游引物：0 -actin-F :5' -AGGTTCCGTTGTC CCG-3' ； 0 -actin-R :5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'。
[0011] 本發(fā)明所述特異性引物快速檢測牙鲆TLR8基因表達(dá)的方法，其特征在于按如下 步驟進(jìn)行： (1) 使用下述引物進(jìn)行該基因的檢測： 符合熒光PCR反應(yīng)特點(diǎn)的該序列特異上下游引物： TLR8-q-F :5'- AGTTTCACCCGCAGATTG -3' (SEQ ID No. 1) TLR8-q-R :5'- CTGGGATGCCTCCTATGT -3' (SEQ ID No. 2) 以及作為內(nèi)參基因的牙鲆0-actin特異上下游引物： 0 -actin-F :5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3' (SEQ ID No. 3) 0-actin-R :5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3' (SEQ ID No. 4) (2) 總RNA提取與純化：采用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從牙鲆脾臟中提取 得到純化的牙鲆脾臟總RNA ; (3 ) cDNA第一鏈合成：以牙鲆脾臟總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系為20 y L ; (4)實(shí)時(shí)熒光PCR:以上述合成的cDNA第一鏈為模板，上述（1)中TLR8-q_F和 TLR8-q_R、0 -actin-F和0 -actin-R為特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反映，每個(gè)樣 品設(shè)3個(gè)平行管，擴(kuò)增后所得3個(gè)平行管的Ct值取平均數(shù)。
[0012] (5)牙鲆的脾臟組織中TLR8基因的相對表達(dá)量計(jì)算：實(shí)時(shí)熒光PCR完成后，根據(jù) Ct值計(jì)算牙鲆病原感染各時(shí)間段下的A Ct、2 (A Aet)值，計(jì)算方式如下： A Ct = Ct 一 Ct 內(nèi)對照（0 -actin) AA Ct = A Ct - A Ct (0時(shí)健康牙鲆） 以2 (AAet)數(shù)值表示牙鲆脾臟中TLRS基因相對于健康牙鲆TLRS基因的表達(dá)量。
[0013] 本發(fā)明所述的檢測方法，其中每條引物分別配制成濃度為10 ymol/L的貯存液， 工作濃度為〇. 6 y mol/L。
[0014] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開了采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測牙鲆TLR8基因表達(dá)的特異性引 在制備判斷牙鲆是否感染病源以及病原鑒定方面的應(yīng)用。
[0015] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：P〇ly (1:0模擬病毒在腹腔注射牙鲆后3小時(shí)內(nèi)，牙鲆脾臟TLR8 基因的表達(dá)量增高，而后，TLR8表達(dá)量降低至0時(shí)的水平之下。當(dāng)用遲鈍型愛德華氏菌牙 腹腔注射牙鲆后，牙鲆脾臟TLR8基因的表達(dá)量沒有顯著變化。牙鲆TLR8基因表達(dá)量的改 變，提示我們TLR8參與了牙鲆對Poly (I: C)模擬病毒的免疫應(yīng)答反應(yīng)，有潛力成為牙鲆病 毒感染的早期監(jiān)測指標(biāo)。
[0016] 本發(fā)明更加詳細(xì)的試驗(yàn)方法如下： 牙鲆TLR8基因的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法可通過以下步驟實(shí)現(xiàn)： (1)引物設(shè)計(jì)：根據(jù)TLR8的全長序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)適用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢 測的特異性引物，引物序列如下： TLR8-q-F :5'- AGTTTCACCCGCAGATTG -3' TLR8-q-R :5'- CTGGGATGCCTCCTATGT -3' TLR8的PCR產(chǎn)物預(yù)計(jì)長度為156 bp，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增后的產(chǎn)物長度與預(yù) 計(jì)產(chǎn)物長度一致，且為單一條帶，說明所設(shè)計(jì)的引物具有很強(qiáng)的特異性，適合用于實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR檢測；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。
[0017] 同時(shí)，根據(jù)NCBI里提供的牙鲆-actin的cds序列（EU090804)設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒 光PCR內(nèi)對照的引物，引物序列如下： 0 -actin-F :5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3' 0 -actin-R :5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3' 后-actin的PCR產(chǎn)物預(yù)計(jì)長度為150 bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增后的產(chǎn)物長 度與預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度一致，且為單一條帶