一種以流感病毒為載體的hcv核酸檢測(cè)用質(zhì)控品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于HCV核酸檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種以流感病毒為載體的HCV核酸檢測(cè) 用質(zhì)控品及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎病毒（h印atitis C virus，HCV)是一種經(jīng)血液傳播的RNA病毒，可以引 發(fā)各種慢性肝病，其中包括肝硬化和肝細(xì)胞癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球HCV的感染率約 為3%，估計(jì)約1. 7億人患有慢性丙肝，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3. 5萬(wàn)例。我國(guó)是HCV慢 性感染率高發(fā)國(guó)家之一，約有3800萬(wàn)HCV感染者。HCV慢性感染導(dǎo)致肝臟發(fā)生慢性炎癥壞 死和纖維化，部分患者可能發(fā)展成肝硬化乃至肝癌，可嚴(yán)重影響生命健康。因此，對(duì)其進(jìn)行 快速、準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)至關(guān)重要。
[0003] 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR因其靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確與高通量等 優(yōu)點(diǎn)，已逐步成為HCV檢測(cè)的一線方法，廣泛用于疾病的早期診斷、病情估計(jì)、指導(dǎo)用藥和 療效監(jiān)測(cè)中。
[0004] 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR包括樣本核酸提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA、cDNA擴(kuò)增和產(chǎn)物分 析四個(gè)步驟，檢測(cè)過(guò)程較為復(fù)雜，容易受到多種因素的影響。這些因素可能源自于樣本自 身，如標(biāo)本中血紅素、肝素、尿素等干擾物質(zhì)會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。也可來(lái)源于人為 因素，如實(shí)驗(yàn)人員操作失誤造成樣本核酸抽提質(zhì)量不佳或者核酸丟失，可導(dǎo)致靶值偏低乃 至假陰性結(jié)果。另外，保存、運(yùn)輸環(huán)境中RNA酶和溫度等因素引起的病毒核酸降解也不容忽 視。因此，核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中必須采用嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，需要特定的陽(yáng)性質(zhì)控品防止假陰 性結(jié)果，這對(duì)于保證核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠具有重要的意義。
[0005] 目前HCV核酸檢測(cè)用質(zhì)控品主要有以下幾種：裸露的RNA、陽(yáng)性病人血清或血漿、 人工制備的假病毒顆粒。裸露的RNA由cDNA經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到，極易被環(huán)境中的核糖核酸酶 (RNase)所降解而難于長(zhǎng)期保存，且其不參與核酸抽提過(guò)程，因而不能反映病毒的提取效 率。陽(yáng)性病人血清或血漿相對(duì)穩(wěn)定，可對(duì)標(biāo)本核酸提取及反轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但因其有潛 在生物安全性、樣本來(lái)源有限等問(wèn)題限制了其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。為此，相關(guān)政府職能部 門鼓勵(lì)生產(chǎn)廠家研發(fā)人工合成質(zhì)控品以替代上述質(zhì)控品。
[0006] 近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量探索，當(dāng)前最具代表性的就是Armored RNA技術(shù) 制備的假病毒顆粒。它利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性，采用原核表達(dá)技術(shù)將特 定病毒RNA包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)得到帶有檢測(cè)靶標(biāo)的噬菌體樣顆粒。噬菌體顆 粒RNA由衣殼蛋白保護(hù)，能夠抵抗核酸酶及各種理化環(huán)境因素，具有穩(wěn)定性好、無(wú)生物傳染 隱患、可全程監(jiān)測(cè)核酸檢測(cè)過(guò)程等特點(diǎn)，因而解決了傳統(tǒng)HCV RNA質(zhì)控品自身存在的一些問(wèn) 題。目前已有研究機(jī)構(gòu)利用此技術(shù)平臺(tái)人工合成能模擬臨床標(biāo)本的HCV質(zhì)控品，在HCV臨 床分子診斷中展示了較好的應(yīng)用前景。
[0007] 然而，Armored RNA技術(shù)生產(chǎn)的噬菌體病毒顆粒在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些不足。 首先，在國(guó)外Armored RNA技術(shù)因?qū)＠Ｗo(hù)問(wèn)題導(dǎo)致商品化質(zhì)控品價(jià)格昂貴（http:// asuragen. com/)，非普通臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室所能承擔(dān)，這大大限制該產(chǎn)品的臨床應(yīng)用。而在 國(guó)內(nèi)，因缺失相應(yīng)的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量管理規(guī)范，目前尚未有Armored RNA技術(shù)制備的商品 化HCV質(zhì)控品，僅有部分機(jī)構(gòu)自行制備，質(zhì)控品質(zhì)量不能得到有效保證。其次，對(duì)于有包膜 RNA病毒，如HCV，其包膜為脂質(zhì)雙分子層，與噬菌體顆粒表面堅(jiān)固的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)不同，使 用衣殼蛋白噬菌體不能準(zhǔn)確反映樣本處理檢測(cè)過(guò)程中的變化，因而不能簡(jiǎn)單地使用衣殼病 毒噬菌體作為此類病毒檢測(cè)中的質(zhì)控品。因此，理想質(zhì)控品的制備應(yīng)需符合相應(yīng)質(zhì)量管理 標(biāo)準(zhǔn)，還應(yīng)與檢測(cè)對(duì)象具有相同的生物學(xué)特性，這對(duì)于確保HCV核酸檢測(cè)的可信性具有重 要意義。
[0008] 病毒學(xué)研究近些年獲得了巨大發(fā)展，如流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)。特別是 Hoffmann等建立的8質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)，利用同一質(zhì)粒模板同時(shí)生成流感病毒的vRNA 和mRNA，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可成功拯救得到流感病毒。相比之前拯救系統(tǒng)，8質(zhì)粒系統(tǒng)大 大減少了質(zhì)粒的使用數(shù)量，從而顯著提高了病毒拯救效率。該技術(shù)使得人們可以對(duì)病毒基 因直接進(jìn)行修飾，按預(yù)期計(jì)劃獲得目標(biāo)重配病毒，目前已廣泛用于病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能、 病毒的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和致病機(jī)制研究，侯選疫苗毒株的研制等方面。
[0009] 當(dāng)前，已有大量關(guān)于流感病毒作為外源基因載體用于基因治療和傳染病防控等方 面的報(bào)道，如流感嵌合副流感、衣原體、結(jié)核桿菌、呼吸道合胞病毒、艾滋病毒和腫瘤等。但 目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)流感病毒作為載體用于質(zhì)控品方面的報(bào)道。因此，利用流感反向遺傳技術(shù) 拯救含有HCV保守目的基因的突變流感病毒，然后參考流感疫苗生產(chǎn)過(guò)程制備HCV質(zhì)控品 將是核酸檢測(cè)用質(zhì)控品研究領(lǐng)域新的里程碑。從病毒檢測(cè)診斷角度看，流感病毒自身即是 脂質(zhì)雙分子層包裹內(nèi)部核酸，它真實(shí)反映了 HCV的結(jié)構(gòu)特性，比外裹衣殼蛋白的噬菌體更 能反映HCV及其在樣本中的真實(shí)情況。同時(shí)，質(zhì)控品的制備模擬流感疫苗的生產(chǎn)及其質(zhì)量 控制要求，這些均有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（參見中國(guó)藥典中"流感全病毒滅活疫苗"相關(guān)內(nèi)容）。 因此，流感病毒為載體的HCV質(zhì)控品可以最大程度模擬真實(shí)病毒核酸檢測(cè)過(guò)程，包括同樣 的特異性和靈敏度，真正實(shí)現(xiàn)對(duì)HCV核酸檢測(cè)的全方位監(jiān)測(cè)，對(duì)于保證HCV RNA檢測(cè)結(jié)果的 準(zhǔn)確可靠具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種以流感病毒為載體的HCV核酸檢測(cè)用質(zhì) 控品及其制備方法，該質(zhì)控品可真實(shí)模擬HCV病原體，實(shí)現(xiàn)對(duì)HCV檢測(cè)的全方位監(jiān)測(cè)；易于 大規(guī)模制備，降低成本，穩(wěn)定性好，易于保存和運(yùn)輸，具有良好的應(yīng)用前景。
[0011] 本發(fā)明的一種以流感病毒為載體的HCV核酸檢測(cè)用質(zhì)控品，所述質(zhì)控品由攜帶 HCV保守基因的重組流感病毒經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)滅活純化而得。攜帶HCV基因的重組流感病毒能 通過(guò)病毒拯救方法在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行拯救，并能在雞胚中大量擴(kuò)增。
[0012] 所述流感病毒載體為（A/Puerto Rico/8/34)PR8病毒，也可以是其他亞型流感病 毒骨架。
[0013] 所述HCV保守基因插入的基因片段為PR8病毒基因組的NS基因（編碼流感病毒 NS1和NEP蛋白的RNA片段8,序列信息詳見GeneBank，序列號(hào)：AF389122)。
[0014] 所述HCV保守基因?yàn)镠CV 5' UTR，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示（序列信息 詳見 GeneBank，序列號(hào)：AF176573)〇
[0015] 所述攜帶HCV保守基因的重組流感病毒的NS基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 示。自5'到3'端序列依次為：PR8病毒NS基因的5'非編碼區(qū)，NS1蛋白編碼區(qū)（缺失NS1 終止密碼子），GSG linker序列，HCV 5'UTR的反向互補(bǔ)序列，GSG linker序列，豬捷申病 毒（porcine teschovirus - 1，PTV-1)的2A肽序列，NEP蛋白編碼區(qū)，PR8病毒NS基因的 3'非編碼區(qū)。
[0016] 本發(fā)明的一種以流感病毒為載體的HCV核酸檢測(cè)用質(zhì)控品的制備方法，包括：
[0017] (1)構(gòu)建用于流感病毒拯救的在PR8病毒NS基因上插入HCV保守基因的質(zhì)粒；
[0018](2)將上述構(gòu)建好的質(zhì)粒，與分別轉(zhuǎn)錄表達(dá)PR8病毒PB2 (AF389115)、 PB1 (AF389116)、PA(AF389117)、HA(AF389118)、NP(AF389119)、NA(AF389120)、M(AF389121) 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，拯救獲得攜帶HCV 5' UTR的重組流感病毒；
[0019] (3)將上述重組流感病毒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、滅活、純化，制備成HCV核酸檢測(cè)用質(zhì)控 品（參照中國(guó)藥典中"流感全病毒滅活疫苗"相關(guān)內(nèi)容）。
[0020] 有益效果
[0021] (1)易于大規(guī)模制備，降低成本。因重組流感病毒在雞胚中生長(zhǎng)良好，參照流感全 病毒滅活疫苗生產(chǎn)工藝，2~3天即可獲得高濃度病毒粒子，從而實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)供應(yīng)，顯著 降低質(zhì)控品成本。
[0022] (2)穩(wěn)定性好，易于保存和運(yùn)輸。由于基因組RNA包裹在流感病毒包膜蛋白內(nèi)，因 而具有耐RNase的特點(diǎn)，可避免被外界環(huán)境中RNase降解。室溫條件下可保存一個(gè)月，4°C 可保存至少8個(gè)月，作為質(zhì)控品具有良好的穩(wěn)定性。
[0023] (3)無(wú)生物傳染性，安全可靠。質(zhì)控品成品經(jīng)甲醛滅活，在雞胚中經(jīng)滅活驗(yàn)證無(wú)傳 染性，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，也不會(huì)對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室人員造成危害。
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