降低多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物中的內(nèi)毒素的制作方法
【專利說明】降低多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物中的內(nèi)毒素
[0001] 背景
[0002] 領(lǐng)域
[0003] 本申請通常涉及降低多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物（polymerconjugate)中內(nèi)毒素含 量的方法。具體地，本申請涉及降低可用于一些藥物遞送用途的多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物 中的內(nèi)毒素含量。
[0004]描沭
[0005] 基于氨基酸的聚合物已被認(rèn)為是新型生物材料的潛在來源。具有良好生物相容性 的聚氨基酸類已被研究用于遞送低分子量化合物。少部分的聚谷氨酸類和共聚物已經(jīng)被確 定為用于藥物遞送的候選材料。
[0006] 概述
[0007] 本文所述的一些實施例通常涉及純化多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物的方法，包括將起 始的多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物與第一溶劑系統(tǒng)混合形成溶液；通過降低該溶液的pH來沉 淀沉淀一部分起始多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物；和用第二溶劑系統(tǒng)洗滌該沉淀的多聚陰離子 聚合物偶聯(lián)物，其中，所述第一溶劑系統(tǒng)和第二溶劑系統(tǒng)中的一個或兩個包括水混溶性有 機溶劑，以提供純化的多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物，其中純化的多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物中 內(nèi)毒素的存在量低于起始多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物中內(nèi)毒素的存在量。
[0008] 本文所述的一些實施例通常涉及純化聚（y-L-谷氨酰谷氨酸）聚合物偶聯(lián)物、聚 (谷氨酸）_聚合物偶聯(lián)物、聚（Y-L-谷氨酰基-天冬氨酸）_聚合物偶聯(lián)物、聚（天冬氨 酸）_聚合物偶聯(lián)物、聚（L-天門冬氨酰-谷氨酸）_聚合物偶聯(lián)物、聚（L-天門冬氨酰-天 冬氨酸）_聚合物偶聯(lián)物及其共聚物的方法，可包括：將前文提及的起始聚合物偶聯(lián)物之一 與第一溶劑系統(tǒng)混合形成溶液；通過降低該溶液的pH來沉淀一部分起始多聚聚合物偶聯(lián) 物；和用第二溶劑系統(tǒng)洗滌該沉淀的聚合物偶聯(lián)物（polymerconjugate)，其中，所述第一 溶劑系統(tǒng)和第二溶劑系統(tǒng)中的一個或兩個包括水混溶性有機溶劑，以提供前文提及的純化 聚合物偶聯(lián)物之一，其中該純化的聚合物偶聯(lián)物中內(nèi)毒素的存在量低于起始聚合物偶聯(lián)物 中內(nèi)毒素的存在量。
[0009] 本文所述的一些實施例通常涉及純化聚（y-L-谷?；?谷氨酸）-聚合物偶聯(lián)物 的方法，其可以包括：將起始聚（Y-L-谷?；?谷氨酸）-聚合物偶聯(lián)物與第一溶劑系統(tǒng) 結(jié)合形成溶液；通過降低溶液的pH來沉淀一部分起始聚（y-L-谷氨?；?谷氨酸）-聚 合物偶聯(lián)物；和用第二溶劑系統(tǒng)洗滌該沉淀的聚（Y-L-谷氨?；?谷氨酸）-聚合物偶聯(lián) 物，其中，所述第一溶劑系統(tǒng)和第二溶劑系統(tǒng)中的一個或兩個包括水混溶性有機溶劑，以提 供純化的聚（y-L-谷氨酰基-谷氨酸）-聚合物偶聯(lián)物，其中純化的聚（y-L-谷酰基-谷 氨酸）-聚合物偶聯(lián)物中內(nèi)毒素的存在量低于起始聚（Y-L-谷氨?；?谷氨酸）-聚合物 偶聯(lián)物中內(nèi)毒素的存在量。 附圖簡介
[0010] 圖1概述了降低多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物中內(nèi)毒素含量的示例過程。
[0011] 圖2概述了降低PGGA-PTX中內(nèi)毒素含量的示例過程。
[0012] 圖3概述了將多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物從其酸形式轉(zhuǎn)換到鹽形式的示例過程。
[0013] 圖4概述了將PGGA-PTX從其酸形式轉(zhuǎn)換到鹽形式的示例過程。
[0014] 詳細(xì)描述
[0015] 術(shù)語
[0016] 除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常 理解的相同的含義。本文引用的所有專利、申請、申請公布和其它出版物通過引用全文納入 本文，除非另有說明。倘若存在對一個術(shù)語的多個定義，以本部分為準(zhǔn)，除非另有說明。
[0017] 如本文所用，術(shù)語"水溶性的"指可以完全溶于水的化合物，pH等于7時，濃度 至少為每l〇〇mL水含3g。參照Shriner等，《有機化合物的系統(tǒng)鑒定》（TheSystematic IdentificationofOrganicCompounds) § 5.L1，（第 6 版 1980) 〇
[0018] 如本文所用，術(shù)語"聚合物"包括具有各種各樣分子結(jié)構(gòu)的均聚物和共聚物，除非 另有說明。
[0019] 如本文所用，術(shù)語"聚合物偶聯(lián)物"描述了連接于一種或多種類型的生物活性劑 或藥物，例如紫杉醇的聚合物。例如，如本文所用的PGGA-PTX是一種聚合物偶聯(lián)物，其中 聚_(y-L-谷氨?；?谷氨酸）（PGGA)連接于紫杉醇（PTX)。合適的生物學(xué)上有用的藥劑 示例包括但不限于，靶向劑、顯像劑（例如光學(xué)成像或磁共振顯像劑）以及穩(wěn)定劑（例如聚 乙二醇）。生物學(xué)上有用的制劑和/或藥物可以直接連接于適當(dāng)?shù)姆肿樱ɡ鏟TX)，或者， 適當(dāng)?shù)姆肿涌梢酝ㄟ^連接基團直接連接于聚合物。所述連接基團可以是相對較小的化學(xué)部 分，例如酯類，酰胺或胺鍵，或者可以是較大的化學(xué)部分，例如烷基酯鍵或環(huán)氧烷鍵。
[0020]靶向劑的示例包括：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)多肽，環(huán)狀（fKRGD)，纖連 蛋白，葉酸，半乳糖，載脂蛋白，胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，纖維母細(xì)胞生長因子（FGF)，表皮生長因 子（EGF)和抗體。靶向劑可與選自下組的受體相互作用：av，-整聯(lián)蛋白，葉酸，脫唾液 酸糖蛋白，低密度脂蛋白（LDL)，胰島素受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，纖維母細(xì)胞生長因子（FGF)受 體，表皮生長因子（EGF)受體，以及抗體受體。
[0021] 光學(xué)顯像劑的示例包括：吖啶染料、香豆素染料、若丹明類染料、咕噸染料、花青染 料以及花染料。具體的光學(xué)顯像劑包括：德克薩斯紅（TexasRed)、AlexaFluor?系列染 料、BODIPY?染料、Fluorescein,OregonGreen?:染料和RhodamineGreen?染料。
[0022] 磁共振顯像劑的示例包括：順磁性金屬化合物（例如Gd(III))，例如：
[0023]
[0024] 如本文所用，術(shù)語"多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物"描述了在中性pH值（即pH= 7)時 帶負(fù)電荷的聚合物偶聯(lián)物。多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物的示例包括但不限于，聚-(Y-L-谷 氨?；鵢谷氨酸）聚合物偶聯(lián)物、聚（谷氨酸）聚合物偶聯(lián)物、聚（天冬氨酸）聚合物偶聯(lián) 物、聚（y-L-谷氨酰基-天冬氨酸）聚合物偶聯(lián)物、聚（天門冬氨酰-天冬氨酸）聚合物 偶聯(lián)物、聚（天門冬氨酰-谷氨酸）聚合物偶聯(lián)物、聚（天冬氨酸）聚合物偶聯(lián)物及其共聚 物。
[0025] 如本文所用，聚（谷氨?；?天冬氨酸）（PGAA)指由式（A)的重復(fù)單元構(gòu)成或基 本上由式（A)的重復(fù)單元構(gòu)成的聚合物，其中，每個RA可以獨立為氫或堿金屬。式（A)的 重復(fù)單元可以是鹽，例如，鈉鹽或酸的形式。因此，如本文所用，聚（谷氨酰基-天冬氨酸） 指的是包含式（A)的酸形式，式（A)的鹽形式或兩者都有的聚合物，除非另有說明。
[0026]
[0027] 如本文所用，聚-(y-L-谷氨?；?谷氨酸）（PGGA)指由本文所述的式（B)的重復(fù) 單元構(gòu)成或基本上由式（B)的重復(fù)單元構(gòu)成的聚合物，其中，每個RB可獨立為氫或堿金屬。 式（B)的重復(fù)單元可以是鹽，例如，鈉鹽或酸的形式。因此，如本文所用，聚（谷氨?；?谷 氨酸）指的是包含式（B)的酸形式，式（B)的鹽形式或兩者都有的聚合物，除非另有說明。
[0028]
[0029] 如本文所用，聚（天冬氨酸）（PA)指由式（C)、式（D)所示重復(fù)單元或兩者構(gòu)成或 基本上由式（0、式（D)所示重復(fù)單元或兩者構(gòu)成的聚合物，其中，每個R4PRd可獨立地為 氫或堿金屬。一些聚（天冬氨酸）可以是鹽，例如，鈉鹽或酸的形式。式（C)和/或式（D) 的重復(fù)單元可以是鹽，例如，鈉鹽或酸的形式。因此，如本文所用，聚（天冬氨酸）指的是可 包含式（C)和/或式⑶的酸形式，式（C)和/或式⑶的鹽形式或兩者都有的聚合物，除 非另有說明。
[0030]
[0031] 如本文所用，聚（谷氨酸）（PGA)指由式（E)、式（F)所示重復(fù)單元或兩者構(gòu)成或基 本上由式（E)、式（D)所示重復(fù)單元或兩者構(gòu)成的聚合物，其中，每個R，PRF可獨立地為氫 或堿金屬。式（E)和/或式（F)的重復(fù)單元可以是鹽，例如，鈉鹽或酸的形式。因此，如本 文所用，聚（谷氨酸）指的是可包含式（E)和/或式（F)的酸形式，式（E)和/或式（F)的 鹽形式或兩者都有的聚合物，除非另有說明。
[0032]
[0033] 如本文所用，"CjljCn "中，"m"和"n"為整數(shù)，指的是基團中碳原子的數(shù)目或環(huán)中碳 的數(shù)目。換言之，所述基團或環(huán)可以包括m至n個碳原子，包括端點。因此，例如，"(；到(：4烷 基"指含有 1-4個碳原子的所有烷基，S卩，ch3-、ch3ch2-、ch3ch2ch2-、（ch3)2ch-、ch3ch2ch2ch2-、 CH3CH2CH(CH3) -、CH3CH(CH3)CH2-和（CH3) 3c-。如果未指定m和n，應(yīng)假定是本文提供的定義 中所述的最寬范圍。
[0034] 應(yīng)理解的是，本文所述的具有一個或多個手性中心的任何化合物中，如果沒有明 確示出絕對構(gòu)型，那么每個中心可以獨立地為R-構(gòu)型或S-構(gòu)型或其混合物。因此，本文提 供的化合物可以是光學(xué)純或立體異構(gòu)體混合物。此外，應(yīng)理解的是，在具有一個或多個雙鍵 從而產(chǎn)生可定義為E或Z的幾何異構(gòu)體的任何化合物中，各雙鍵可獨立地為E或Z及其混 合物。同樣地，所有的互變異構(gòu)形式也應(yīng)包括在內(nèi)。
[0035] 除非另有注明，如本文所用，任一保護基團的縮略語，氨基酸和其它化合 物與它們的通常用語、公認(rèn)縮寫或IUPAC-IUP委員會的生物化學(xué)命名法（參考 Biochem. 11:942-944(1972))相一致。
[0036] 降低內(nèi)毒素水平的方法
[0037] 整體上，本文所述的一些實施例涉及降低多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物中內(nèi)毒素含量 的方法。內(nèi)毒素，也稱為脂多糖（LPS)，是市售蛋白質(zhì)或生物活性物質(zhì)中的主要污染物。內(nèi) 毒素的存在經(jīng)常使得對主要成分的生物活性研究變復(fù)雜。在重組蛋白制品中小量內(nèi)毒素的 存在可在宿主器官中引起副作用，例如內(nèi)毒素休克，組織損傷，甚至死亡。因此，移除藥物， 血管注射劑，和其它生物和醫(yī)藥產(chǎn)品中的內(nèi)毒素很重要。
[0038] 多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物中內(nèi)毒素的主要來源可歸因于正切流動過濾（TFF)純 化中使用的大量水。高質(zhì)量的無內(nèi)毒素注射用水（WFI)可以用于TFF純化；然而，大規(guī)模純 化的操作費用會非常高，因此，大規(guī)模精制成本高昂。
[0039] 用于產(chǎn)生低內(nèi)毒素水平產(chǎn)品的其他工藝是已知的。然而，沒有一個工藝具有廣泛 適用性。例如，陰離子交換色譜法可能用于帶正電荷的蛋白質(zhì)，例如尿激酶的精制。然而， 由于吸附作用，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)的精制已顯示出伴隨著相當(dāng)大的產(chǎn)品損失。對于小型蛋 白質(zhì)，如肌紅蛋白（分子量~18kDa)，超濾可用于除去大的內(nèi)毒素凝聚物。然而，對于大型 蛋白質(zhì)，例如免疫球蛋白（分子量~150kDa)，超濾已被證明無效。因此，對于具有高分子量 (Mff>20kDa)的聚陰離子聚合物偶聯(lián)物，超濾和陰離子交換色譜都不適用。因此，需要一個簡 易，可放大的和合算的內(nèi)毒素去除方法，以降低大的聚陰離子聚合物偶聯(lián)物，如PGGA-聚合 物偶聯(lián)物和PGA-聚合物偶聯(lián)物中的內(nèi)毒素含量。
[0040] 如本文所述，采用酸沉淀聚合物偶聯(lián)物，溶劑混合物的選擇性溶解和洗去內(nèi)毒素， 可以將起始多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物中的內(nèi)毒素水平降至藥用合適的水平。
[0041] 通過降低內(nèi)毒素水平純化多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物的方法可包括將起始多聚陰 離子聚合物偶聯(lián)物與第一溶劑系統(tǒng)混合形成溶液；通過降低該溶液的pH來沉淀一部分起 始多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物；和用第二溶劑系統(tǒng)洗滌該沉淀的多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物以 提供純化的多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物，其中純化的多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物中內(nèi)毒素的存 在量低于起始多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物中內(nèi)毒素的存在量。在一些實施例中，起始多聚陰 離子聚合物偶聯(lián)物和純化的多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物可以是聚陰離子抗癌藥物偶聯(lián)物。在 一些實施例中，第一溶劑系統(tǒng)包括水混溶性有機溶劑。在一些實施例中，第二溶劑系統(tǒng)包括 水混溶性有機溶劑。
[0042] 在一些實施例中，本文所述的多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物可以是PGGA-聚合物偶聯(lián) 物。在一些實施例中，本文所述的PGGA-聚合物偶聯(lián)物可以是PGGA-抗癌藥物偶聯(lián)物，例如 那些本文所述的PGGA-抗癌藥物偶聯(lián)物。在一些實施例中，純化PGGA-抗癌藥物偶聯(lián)物的 方法可包括將起始PGGA-抗癌藥物偶聯(lián)物與第一溶劑系統(tǒng)混合形成溶液；通過降低該溶液 的pH來沉淀一部分起始PGGA-抗癌藥物偶聯(lián)物；和用第二溶劑系統(tǒng)洗滌該沉淀的PGGA-抗 癌藥物偶聯(lián)物以提供純化的PGGA-抗癌藥物偶聯(lián)物，其中，純化的PGGA-抗癌藥物偶聯(lián)物中 內(nèi)毒素的存在量低于起始PGGA-抗癌藥物偶聯(lián)物中內(nèi)毒素的存在量。
[0043] 在一些實施例中，本文所述的多聚陰離子聚合物偶聯(lián)物可以是PGA-聚合物偶聯(lián) 物。在一些實施例中，本文所述的PGA-聚合物偶聯(lián)物可以是PGA-抗癌藥物偶聯(lián)物，例如 PGA-PTX。在一些實施例中，純化PGA