用于體外干細胞增殖和組織再生的生長基質的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請依照35U.S.C. 119(e)要求提交于2013年1月28日的美國臨時申請第 61/757, 378號的權益，其內容以其整體并入本文。
[0003] 政府支持聲明
[0004] 本發(fā)明在新澤西州腦損傷研究委員會授予的合同09-3207-BIR-E-2和 CBIR12FEL025的政府支持下完成。
技術領域
[0005] -般地，本發(fā)明涉及組織工程領域。特別地，本發(fā)明涉及重組蛋白-成纖維細胞生 長因子-2 (FGF-2)的穩(wěn)定化，以促進其在干細胞中的生物學活性，以及用于培養(yǎng)干細胞的 方法。
【背景技術】
[0006] 干細胞療法是組織工程和再生的有前景的領域，但是其在修復中樞神經系統(tǒng) (CNS)尤其是嚴重損傷后的大腦中僅表現出了有限的成功。CNS損傷常引起廣泛的特征在 于神經元和神經膠質細胞死亡的組織損傷，其中，存在實質上無功能的內源性神經干細胞 (NSC)的細胞替換。在中風動物模型中，據報道，少于1%的損毀神經元被室下區(qū)（SVZ)的內 源性神經前體所代替。在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI)的動物模型中也獲得了類似的結果。Salman 等人（JNeurotrauma21:283 - 292, 2004)觀察到SVZ中的神經前體（NP)重新填充到機械 性損傷的皮層中。損傷區(qū)域附近的SVZ細胞產生了非常小比例的新神經元（未定量），而 大部分的移植細胞成為星形膠質細胞。直接移植NP到腦部病變的半影（penumbra)中產生 很小的進展（Sanberg等人，BrMedBull101:163-181,2012)。大多數移植的細胞不能存 活（Shindo等人，JMedInvest53:42 - 51，2006)或分化成神經膠質細胞而不是神經元 (Shear等人，BrainRes1026:11 - 22, 2004)。例如，Shear等人（2004)發(fā)現通過移植NP 產生了NG2陽性神經膠質細胞，并且Sun等人（ExpNeurol216:56 - 65, 2011)觀察到他們 移植的大部分前體成為了 01ig2陽性細胞（可能的神經膠質細胞）。Ma等人（MolMedR印 4:849 - 856, 2011)報道了僅有4%的他們所移植的NP是NSC，從而僅有11 %分化成表達神 經元標記物的細胞。直接移植附著到支持基質上的干細胞到病變部位可能更有效地促進再 生。Tate等人（JTissueEngRegenMed3:208 - 217,2009)示出了在TBI后移植到支持 性纖連蛋白和層粘連蛋白基質中的NP的長期生存的改善。接受這些移植的動物相比于未 接受NP的受傷小鼠，在空間學習任務中顯示出改善的能力（Tate等人，2009)。
[0007] 利用材料工程學和分子生物學的原理，組織工程師正在開發(fā)有機替代物以支持或 替換部分故障組織或器官以創(chuàng)建替代物。創(chuàng)建這些替代物的常見方法是使用活細胞、支架 和信號分子。Evans(SeminSurgOncol19:312 - 318, 2000)鑒定了對于神經組織支架而言 必要的四個組分：生長促進蛋白、細胞外基質（ECM)、支持細胞（通常是干細胞）和促進軸 突再生的分子。然而，干細胞不僅需要與細胞外基質以及生長促進蛋白相接觸以增殖，還需 要保持干細胞的基本特性（干性（sternness))。通過整聯蛋白受體發(fā)揮作用的細胞外基質 因子如層粘連蛋白和纖連蛋白已被證明對于干細胞自我更新是重要的。具有對于刺激胚胎 和成體干細胞的增殖而言所必要的生長促進蛋白，FGF-2,已被證明是至關重要的。
[0008]CNS的創(chuàng)傷性損傷適合于應用生物材料支架，這是因為存在細胞和ECM的廣泛的 且局部的損失。支架可以作為移入的細胞和宿主組織的人造基質和支持性網絡。此外，其 作為防止神經膠質疤痕的物理和化學屏障，其抑制軸突再生是公知的。ECM還是細胞功能的 重要調節(jié)物。ECM和整合素的相互作用管理著細胞過程如增殖、存活、迀移和分化。
[0009]因此，持續(xù)需要設計用于神經組織的再生療法以開發(fā)模擬天然ECM的生物材料系 統(tǒng)。應設計這樣的生物材料系統(tǒng)來獲得高度適合作為用于細胞移植以修復創(chuàng)傷性腦損傷的 載體的支架。

【發(fā)明內容】

[0010] 由于上述問題、需求和目標，本發(fā)明人已設計了本發(fā)明的實施方式，其中多個干細 胞可以維持在2-D和3-D基質上，所述基質已被修飾以穩(wěn)定其中的生長促進蛋白。因此，可 以使用這些基質（或生物材料支架），以例如促進CNS再生。
[0011] 在一個示例性實施方式中，培養(yǎng)干細胞群的方法依賴于將成纖維細胞生長因子 (FGF)固定于培養(yǎng)板的表面上。此方法通常有以下步驟：（i)用脫乙酰殼多糖溶液包被腔 室底部；（ii)干燥脫乙酰殼多糖溶液以形成脫乙酰殼多糖層；（iii)中和脫乙酰殼多糖層 的酸度；（iv)將肝素結合到脫乙酰殼多糖層；(v)使用京尼平（genipin)將肝素交聯到脫 乙酰殼多糖層；(vi)結合生長促進蛋白；(vii)應用附著組分（例如，細胞外基質蛋白或細 胞外基質肽）的溶液；(viii)將附著組分結合到脫乙酰殼多糖，其創(chuàng)建多功能膜；和（ix) 將干細胞群接種到腔室并培養(yǎng)干細胞。方法還可以在添加各個組分間有洗滌/漂洗的步 驟。在一個優(yōu)選的實施方式中，生長促進蛋白是一種或多種生長因子，如成纖維細胞生長因 子-2 (FGF-2)。不受理論束縛，鋪在所公開的多功能基質上的干細胞能保持在多能和增殖 狀態(tài)而不提供可溶性的生長促進蛋白。此外，相比于保持在補充有可溶性的生長促進蛋白 如FGF-2的培養(yǎng)基中的纖連蛋白包被的基質上的細胞，干細胞可以保持較小的成熟度和更 尚的增殖性。
[0012] 使用所公開的方法培養(yǎng)的干細胞高度適合于細胞移植以修復組織損傷，如創(chuàng)傷性 腦損傷。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了通過向有治療需求的受試者施用多功能基質來 修復受傷的哺乳動物組織的方法。多功能基質包含脫乙酰殼多糖_(京尼平）_生長促進蛋 白結合配偶體，其是固定其上的生長因子（優(yōu)選FGF-2)上，單獨的或與附著組分相組合。 在一個實施方式中，附著組分是纖連蛋白。在另一個實施方式中，附著組分是肽序列精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)或異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸（IKVAV)。
[0013] 在示例性實施方式中，提供具有帶有固定化的FGF-2、肝素、京尼平和脫乙酰殼多 糖的支架的多功能基質。在另一個示例性實施方式中，提供了具有脫乙酰殼多糖的支架、帶 有固定化的FGF-2和纖連蛋白的京尼平連接的肝素的多功能基質。
[0014] 在一個實施方式中，提供了制造可注射的多功能微球支架的方法以獲得高度適合 于作為細胞移植載體以修復創(chuàng)傷性CNS損傷的支架。在示例性實施方式中，作為細胞移植 的載體，脫乙酰殼多糖溶液被電噴霧到凝固浴中以產生微球（范圍：30-100ym)，其隨后可 進行修飾。接種到多功能微球中的原始神經前體可以在培養(yǎng)基中增殖，且包含細胞的微球 足夠小，使得可以使用26直徑（gauge)的漢密爾頓注射器將其注射進先前經歷傷害的CNS 的區(qū)域。因此，這一多功能支架可以用作細胞和生長因子的遞送載體以促進CNS損傷后的 神經組織損傷的再生。
[0015] 在下述實施例中描述了優(yōu)選的方法和材料，其旨在說明而不是限制本發(fā)明。本領 域技術人員將獲悉與本文所描述的相似或等同并且可以用于本發(fā)明的實踐或測試中的方 法和材料。除非另有限定，所有本文所使用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬技術領域 中的技術人員所通常理解的相同的含義。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將通過詳細描述和權利 要求而呈現。
【附圖說明】
[0016] 圖1:對RG3. 6細胞的形態(tài)和增殖的基質效應。RG3. 6 (神經干細胞系）生長于補 充有B27和每天10ng/ml的FGF-2的DMEM/F12中5天。用F-肌動蛋白和DAPI染色細胞。 使用SigmaScanPro測量離核的突起長度。人工計數離核的突起數。誤差棒表示SEM。用 Tukey'sposthoc通過AN0VA測定統(tǒng)計學顯著性。（A)生長于具有各種吸附的肽的脫乙 酰殼多糖包被的皿中的RG3. 6細胞。20X放大。Ln:層粘連蛋白，Fn:纖連蛋白，Gel:明膠， PLL:聚-L-賴氨酸，Col:膠原蛋白，C:對照（僅脫乙酰殼多糖）（B)#* =P〈0. 001比對照 且???=P〈0. 001比層粘連蛋白和明膠。（C)*#P〈0. 001比PLL和對照，* =P〈0. 05比 PLL和對照，以及??=P〈0. 01比層粘連蛋白膠原和明膠。D)用核抗體Ki67和DAPI染色 細胞。比例尺，100ym。
[0017] 圖2:固定化的FGF-2對NSC的增殖和存活的作用。次級NSC作為神經球生長 于補充有B27+/-10ng/ml的FGF-2的DMEM/F12中2天。解離后，細胞生長于有或沒有肝 素（0. 5mg/mL)_京尼平（0.45mM)和FGF-2(1000ng/mL)的脫乙酰殼多糖-纖連蛋白包被 的96孔板上。對照每天僅接受FGF-2。（A)MTT分析（B)C-Fn-FGF-2 (可溶的）對照（C) C-H-G-Fn-FGF-2 (結合的）（D)CHG-Fn。C-Fn:脫乙酰殼多糖-纖連蛋白。CHG-Fn+ :脫乙酰 殼多糖-肝素-京尼平-纖連蛋白+結合的FGF-2。CHG-Fn-:脫乙酰殼多糖-肝素-京尼 平-纖連蛋白，無FGF-2。比例尺：100ym。
[0018] 圖3:固定化的FGF-2對維持NSC的干性和分化的作用。原代NSC生長于補充 有B27土FGF-2的DMEM/F12中。用脫乙酰殼多糖和纖連蛋白包被皿，有或沒有肝素-京 尼平-FGF-2固定化（1yg/mL)。對照每天僅接受FGF-2。在4DIV后收集細胞并分析分 化。㈧相襯圖像20X。（B)在無FGF-2培養(yǎng)基中分化7DIV的二次傳代NSC的三潛能 (Tripotentiality)。（C)分化條件的Western印跡分析：BLBP:腦脂質結合蛋白，TUJ1: 0 111-微管蛋白，GFAP:膠質纖維酸性蛋白，PCNA:增殖細胞核抗原，S0X2:SRY-盒2， MAP-2 :微管相關蛋白2。（D)圖表代表了平均的I0D(積分光密度）比例尺，100ym。
[0019] 圖4:可移植修飾的微球的表征。將通過離子凝結和電噴霧形成的微球與通過同 軸氣流或無空氣形成的球體比較大小。（A)微球制備的示意圖。（B)電噴霧脫乙酰殼多糖 微球的20X相襯圖像。（C)電噴霧微球的尺寸分布。（D)脫乙酰殼多糖微球直徑的頻率分 布。（E)共價交聯至脫乙酰殼多糖微球的肝素的甲苯胺藍染色。（F)NSC生長于用肝素-京 尼平-FGF-2修飾并用纖連蛋白吸附的電噴霧微球上。
[0020] 圖5 :多功能微球很好地適合于CNS損傷的細胞替代療法。（A)RG3. 6細胞在體外 分化并針對0IIITub( 0III-微管蛋白）、GFAP(膠質纖維酸性蛋白）和GFP(綠色熒光蛋 白）染色。（B)在創(chuàng)傷性腦損傷后7天，接受粘附有RG3. 6細胞的多功能微球支架移植物 的動物的腦切片的免疫熒光。針對GFP、巢蛋白和DAPI(4, 6-二脒基-2-苯基吲哚）染色。 (c)僅針對GFP染色的切片。（D)僅針對巢蛋白染色的切片。（A) 20X下，（B-D) 10X放大倍 數下獲取。
[0021] 圖6 :肝素在2D脫乙酰殼多糖膜和3D微球上的離子和共價固定。（A)脫乙酰殼多 糖、肝素和纖連蛋白的結構。（B)肝素固定于通過使用京尼平離子地和共價地脫乙酰殼多糖 包被的孔上。用甲苯胺藍染料染色。（C)肝素、脫乙酰殼多糖和京尼平交聯的脫乙酰殼多 糖-肝素復合物的FT-IR光譜。箭頭指明來自京尼平交聯的脫乙酰殼多糖-肝素復合物的 肝素和脫乙酰殼多糖的官能團。
[0022] 圖7 :在京尼