一種用超臨界流體色譜制備的煙草倍半萜-f及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于煙草化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從煙草中首次提取得到的倍半萜類(lèi) 化合物。同時(shí)，本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法和在抗煙草花葉病毒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草是世界上化學(xué)成分最為復(fù)雜的植物，次生代謝產(chǎn)物非常豐富，經(jīng)過(guò)幾十年的 研究，人們目前從煙草中鑒定出來(lái)的單體化學(xué)物質(zhì)就超過(guò)3000多種，而且還有許多成分尚 未鑒定出來(lái)。雖然吸煙有害健康已得到廣泛認(rèn)可，但煙草仍然對(duì)成千上萬(wàn)的消費(fèi)者有著強(qiáng) 大的吸引力，除尼古丁的成癮性外，煙草中豐富的香味物質(zhì)也發(fā)揮著重要作用。
[0003]超臨界流體色譜是以超臨界流體（例如C02)作為流動(dòng)相的色譜方法，超臨界流 體兼有氣體的低粘度和高擴(kuò)散系數(shù)，約為液體的10~100倍，又有與液體相近的高密度和 強(qiáng)溶解能力，因此超臨界流體色譜兼?zhèn)錃庀嗌V和高效液相色譜兩者的優(yōu)點(diǎn)。它既可以分 離液相色譜不易分離的高相對(duì)分子質(zhì)量化合物，也可以分離氣相色譜不易分離的的熱不穩(wěn) 定、強(qiáng)極性或非揮發(fā)性化合物。因此，超臨界流體色譜非常適合用于天然產(chǎn)物中化合物的分 離制備。
[0004] 倍半砲（sesquiterpenes)是指分子中含15個(gè)碳原子的天然砲類(lèi)化合物。倍半砲 類(lèi)化合物分布較廣，在植物體內(nèi)常以醇、酮、內(nèi)酯等等形式存在于揮發(fā)油中，是揮發(fā)油中高 沸點(diǎn)部分的主要組成部分。多具有較強(qiáng)的香氣和生物活性，是醫(yī)藥、食品、化妝品工業(yè)的重 要原料。為了研究這類(lèi)化合物的構(gòu)效關(guān)系，可進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)更多的倍半萜類(lèi)化合物，并 從中尋找有效的先導(dǎo)化合物和活性基團(tuán)。本發(fā)明借助超臨界流體色譜，從云南烤煙煙葉中 分離得到了一種新的倍半萜類(lèi)化合物，該化合物至今尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，值得一提的是該 化合物具有顯著的抗煙草花葉病病毒活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一方面在于提供一種新的倍半萜類(lèi)化合物，該化合物從云南烤煙煙葉 中分離得到，其分子式為C16H2(]02，經(jīng)過(guò)分析化學(xué)鑒定，其具有下述結(jié)構(gòu)：
[0006]
[0007] 該化合物為淺黃色膠狀物，本發(fā)明人將其中文名命名為煙草倍半萜-F，其英文名 為nicotianasesterpeneF〇
[0008] 本發(fā)明的第二方面提供了上述第一方面所述的倍半萜類(lèi)化合物的制備方法，該方 法包括如下步驟：
[0009] (1)制備煙草提取物浸膏：以煙草葉片為原料，將其粉碎或切成小段，并用第一溶 劑浸泡并提取所述煙草3~5次，每次24h~72h，將提取液合并、過(guò)濾并濃縮后得到所述 煙草提取物浸膏；其中所述第一溶劑是選自甲醇、乙醇或丙酮的有機(jī)溶劑與水的混合物， 其中有機(jī)溶劑占該第砲類(lèi)化合物的制備方法，該方法包括如下步驟：一溶劑的60wt%~ 100wt%，且第一溶劑：煙草=2~4 :1，重量比；
[0010] (2)硅膠柱層析：將上述煙草提取物浸膏用選自純甲醇、純乙醇或純丙酮的第二 溶劑溶解后與為煙草提取物浸膏的〇. 8~1. 2重量倍的60~120目硅膠拌樣，將拌樣后的 混合物再與為煙草提取物浸膏的2~4重量倍的160~300目硅膠混合后干法裝柱，然后 用體積比依次為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6: 4、1:1和1:2的氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫， 將其中體積為8:2的氯仿-丙酮溶液洗脫時(shí)得到的洗脫液稱(chēng)為第一洗脫液。
[0011] (3)超臨界流體色譜分離純化：將上述第一洗脫液通入超臨界流體色譜進(jìn)行分離 純化，該超臨界流體色譜采用10mmX150mm，5ym的Silica2-EP色譜柱，流動(dòng)相二氧化碳 /甲醇（90/10%，質(zhì)量比），流動(dòng)相流速為25mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，第一洗 脫液液每次進(jìn)樣200~500yL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為16. 7min時(shí)所對(duì)應(yīng)的洗 脫液，稱(chēng)為第二洗脫液，將該第二洗脫液脫除溶劑后即得所述倍半萜化合物。
[0012] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括以下進(jìn)一步提純的步驟：將在所述超臨界流 體色譜分離之后得到的所述倍半萜化合物再次溶于甲醇溶液，并以甲醇溶液的為流動(dòng)相， 通過(guò)凝膠柱進(jìn)行層析分離，得到進(jìn)一步提純的所述倍半萜化合物。
[0013] 本發(fā)明的第三方面提供了第一方面所述的倍半萜類(lèi)化合物在制備抗煙草花葉病 毒藥物中的用途。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明倍半萜類(lèi)化合物的核磁共振碳譜；
[0015]圖2為本發(fā)明倍半萜類(lèi)化合物的核磁共振氫譜；
[0016] 圖3為本發(fā)明倍半萜類(lèi)化合物的主要HMBC相關(guān)圖示。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明所制備的倍半萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)以下方法測(cè)定出來(lái)的。本發(fā)明化合物 為淺黃色膠狀物；紫外光譜（溶劑為甲醇），A_(loge) 210 (3. 18)，265 (3. 35)，306 (2. 38)nm;紅外光譜（溴化鉀壓片）vnax 3436, 3087, 2926,1625,1548,1465,1346,1158,1037， 892,783cm1;高分辨質(zhì)譜（HRESIMS)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z267. 1366[M+Na] +(計(jì)算值 267. 1361)。結(jié)合1H和13CNMR譜給出一個(gè)分子式C16H2(]02，不飽和度為7。其紅外光譜顯示 有羥基（3436cm3和苯環(huán)1625,1548,1465cm3功能團(tuán)；紫外光譜在265和306nm處有強(qiáng) 吸收，也證實(shí)化合物中存在共輒結(jié)構(gòu)。從1H和13CNMR譜（數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表-1)信號(hào)可以看出 化合物中有一個(gè)2, 4, 8, 9-四取代的茚母核、一個(gè)異丁烯基、1個(gè)羥甲基、一個(gè)甲基和一個(gè)甲 氧基。根據(jù)H-3和C-2、C-4、C-l、C-5,以及H-6和C-4的HMBC相關(guān)（圖-3)可證實(shí)化合物 中存在茚母核?；衔锏哪负舜_定后，剩余的異丁烯基、羥甲基、甲基和甲氧基為母核上的 取代基。根據(jù)H-10和C-l、C-2和C-3的HMBC相關(guān)可證實(shí)異丁烯基取代在母核的C-2位； 根據(jù)H-14和C-3、C-4和C-5可證實(shí)羥甲基取代在母核的C-4,根據(jù)H-15和C-7、C-8和C-9 的HMBC相關(guān)可證實(shí)甲基取代在母核的C-8位；根據(jù)甲氧基氫和C-9的HMBC相關(guān)，可證實(shí)甲 氧基取代在母核的C-9位。至此本化合物的結(jié)構(gòu)得以確定。
[0018] 表 1?化合物的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)（C5D5N)
[0019]
[0020] 本發(fā)明化合物是首次被分離出來(lái)的，通過(guò)上述核磁共振和質(zhì)譜測(cè)定方法確定為倍 半萜類(lèi)化合物，并表征了其具體結(jié)構(gòu)。采用半葉法進(jìn)行了本發(fā)明化合物的抗煙草花葉病毒 活性測(cè)試，結(jié)果明本化合物的相對(duì)抑制率為33. 6%，超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照寧南霉素的相對(duì)抑制 率31. 5%，說(shuō)明化合物有很好的抗煙草花葉病毒活性?；钚詸z測(cè)結(jié)果揭示了本發(fā)明的化合 物在制備抗煙草花葉病毒藥物中有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、活性較好，可 作為抗煙草花葉病毒藥物研發(fā)的先導(dǎo)性化合物用于抗煙草花葉病毒藥物制劑研發(fā)。
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022] 本發(fā)明所用原料不受地區(qū)和品種限制，任何來(lái)源地的煙草均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，下 面以來(lái)源于云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司的煙草原料對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。除非另有說(shuō) 明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 煙草樣品來(lái)源于云南玉溪，品種為玉溪K326。將煙草取樣2. 0kg粉碎以95%的甲 醇提取5次，每次提取24h，提取液合并，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏105g。浸膏用重量 比2. 0倍量的純甲醇溶解后用120g的100目粗硅膠拌樣，0. 4kg的160目硅膠裝柱進(jìn)行硅 膠柱層析，用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，薄 層色譜（TLC)監(jiān)測(cè)合并相同的部分，得到8個(gè)部分，其中體積配比為8:2的氯仿-丙酮洗脫 部分用沃特斯SFC80Q超臨界流體制備色譜分離，以二氧化碳/甲醇為流動(dòng)相（90/10%，質(zhì) 量比），Silica2-EP(10mmX150mm，5ym)制備柱為固定相，流動(dòng)相流速為25mL/min，紫外檢 測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，每次進(jìn)樣200yL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為16. 7min時(shí)所 對(duì)應(yīng)的洗脫液，多次累加后蒸干，即得本發(fā)明所述的倍半萜化合物粗品；該粗品再用純甲醇 溶解，以純甲醇為流動(dòng)相，用葡聚糖凝膠柱層析純化可得純品。
[0025] 實(shí)施例2
[0026] 煙草樣品