。甲基質(zhì)子信號(hào)Sl.72(SC29. 3) 與 SC64.5(C-24)，SC71.5(C-25)，SC29.1(C-27)有遠(yuǎn)程相關(guān)，S4.27(SC77.2)與 S C42. 1 (C-22)，S C71. 5 (C-23)，S C64. 5 (C-24)，S C71. 5 (C-25)有遠(yuǎn)程相關(guān)，提示存 在結(jié)構(gòu)片段2,說(shuō)明側(cè)鏈具有一個(gè)五元環(huán)的結(jié)構(gòu)。甲基質(zhì)子信號(hào)S0.80(SC15.7)與 S C32. 2 (C-7)，S C38. 5 (C-8)，S C44. 1 (C-13)，S C48. 6 (C-14)有遠(yuǎn)程相關(guān)。甲基質(zhì)子信號(hào) SO. 95(SC12. 8)與 SC38. 5(C-8)，SC48. 6(C-14)，SC31.2(C-15)有遠(yuǎn)程相關(guān)。質(zhì)子信 號(hào) S 4. 63 ( S C46. 5)與 S C83. 8 (C-20)，S C77. 2 (C-21)，S C71. 5 (C-23)有遠(yuǎn)程相關(guān)。圖 5 為gypensapogenin H的IR譜，圖5顯示在3422cm 1有多組吸收，提示有多個(gè)羥基。圖6為 高分辨質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 511. 3386 [M+Na] + (計(jì)算值為511. 3399)。由以上推導(dǎo)可 確定化合物的結(jié)構(gòu)，分子式為C3(]H4S05與圖6給出的分子式一致，是一未見(jiàn)報(bào)道的新化合物， 命名為gypensapogenin H。該化合物的1H NMR、13C NMR譜信號(hào)歸屬及HMBC相關(guān)詳見(jiàn)表1。 結(jié)合1H、13C NMR譜，確定分子式為C3(]H4S05，顯示不飽和度為7。
[0052]
[0053] 表 1 gypensapogenin H 的1H NMR，t NMR (600MHz，150MHz，pyridine_d5)，J in Hz
[0054]
[0055]圖 7 為 gypensapogenin I 的1H NMR(600MHz，pyridine-d5)譜，其有 7 個(gè)甲基的特 征吸收 〇? 85 C3H，s，19_CH3)，0? 88 C3H，s，3〇-CH3)，0? 97 C3H，s，3〇-CH3)，1. 04 C3H，s，29_CH3)， 1.22(3H，s，28-CH3)，1.70(3H，s，27-CH 3)，1.73(3H，s，26-CH3);圖 7 還給出 3 個(gè)連氧碳上 的質(zhì)子信號(hào) S 3. 43 (1H，dd，J = 5. 4,11. 4Hz)，4. 28 (1H，d，J = 9. 0Hz)，4. 64 (1H，m)以及 一個(gè)叔碳上的質(zhì)子信號(hào) 2. 72(1H，dd，J = 5. 4,11. 4Hz)。圖 8 為 gypensapogenin I 的 13C NMR(150MHz，pyridine-d5)譜，共給出30個(gè)碳信號(hào)，推測(cè)其可能為達(dá)瑪烷型三萜皂苷元， 其中包括5個(gè)連氧碳信號(hào)S 83.8,78. 1，77. 1，71.5,71.5。另外，另外，有7個(gè)角甲基信號(hào) 8 29. 3,29. 1,28.1,16. 6,16. 5,16. 3,15. 7〇
[0056] 圖 9 為 gypensapogenin I 的 HSQC 譜，圖 10 為 gypensapogenin I 的 HMBC 譜， 通過(guò)HSQC譜對(duì)除季碳以外的所有碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行了直接相關(guān)的歸屬，在圖10中甲基質(zhì) 子信號(hào)8 1.73(5〇29.3)與5〇64.5(024)，5〇71.5(025)，5〇29.1((：-27)有遠(yuǎn)程相 關(guān)，5 4.28(5〇77.1)與5 042.2(〇22)，5〇71.5((：-23)，5〇64.5((：-24)有遠(yuǎn)程相關(guān)， 5 2.72(5〇77.1)與5〇77.1(021)，5〇71.5(025)，5〇29.3((：-26)有遠(yuǎn)程相關(guān)，提示 存在結(jié)構(gòu)片段1，說(shuō)明側(cè)鏈具有一個(gè)五元環(huán)的結(jié)構(gòu)。甲基質(zhì)子信號(hào)5〇.85(5C16.6)與 SC39.5(C-1)，SC56.4(C-5)，SC51.3(C-9)，SC37.4(C-10)有遠(yuǎn)程相關(guān)；甲基質(zhì)子信號(hào) S 〇? 97 ( S C15. 7)與 S C40. 7 (C-8)，S C50. 3 (C-14)，S C16. 6 (C-19)有遠(yuǎn)程相關(guān)；甲基質(zhì)子 信號(hào) S 1. 70 ( S C29. 1)與 S C64. 5 (C-24)，S C71. 5 (C-25)，S C29. 3 (C-26)有遠(yuǎn)程相關(guān)；甲 基質(zhì)子信號(hào)8 1.73(5〇29.3)與5〇64.5(024)，5〇71.5(025)，5〇29.1((：-27)有遠(yuǎn)程 相關(guān)；甲基質(zhì)子信號(hào) S 〇? 88 ( S C16. 5)與 S C44. 2 (C-13)，S C50. 3 (C-14)，S C31. 8 (C-15)， S C15. 7 (C-18)有遠(yuǎn)程相關(guān)。質(zhì)子信號(hào) S 3. 43 ( S C78. 1)與 S C28. 7 (C-28)，S C16. 3 (C-9) 有遠(yuǎn)程相關(guān)。圖11為gypensapogenin I的HR-T0F-MS譜，該圖給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 515. 3740 [M+Na] + (計(jì)算值為 515. 3712)。圖 12 為 gypensapogenin I 的 IR 譜，在 3426cm 1 有多組吸收，提示有多個(gè)羥基。由以上推導(dǎo)可確定化合物的結(jié)構(gòu)，分子式為(：3。氏205與 HR-T0F-MS給出的分子式一致。經(jīng)scifinder文獻(xiàn)檢索，為一未見(jiàn)報(bào)道的新化合物，命名為 gypensapogenin I〇
[0057] 該化合物的1H NMR、13C NMR譜信號(hào)歸屬及HMBC相關(guān)詳見(jiàn)表2,結(jié)合1H、13C NMR譜， 確定分子式為C3()H5205，顯示不飽和度為5。
[0058]
[0059] 表 2gypensapogenin I 的1H NMR，13C NMR (600MHz，150MHz，pyridine_d5)，J in Hz
[0060] L/1N丄UD丄DO乙/丄* *1 * O/丄厶夕A
[0062] 實(shí)施例4
[0063] 化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I用于抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
[0064] 化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I均為白色粉末，使用DMS0溶解。 分別配制成濃度為100mm〇l/L的母液，儲(chǔ)存于-20°C。臨用時(shí)用相應(yīng)的培養(yǎng)液將其稀釋為 100 ymol/L，10 ymol/L，1 ymol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。DMS0配制的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，DMS0的濃度為 1%。。文獻(xiàn)報(bào)道人參皂苷Rg3、PH)具有抗腫瘤活性且母核結(jié)構(gòu)與待測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似，因 此選用Rg3、PPD為陽(yáng)性對(duì)照藥，濃度為10 y mol/L。
[0065] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為10 X104/mL，接種于96孔板內(nèi)，100 yL/ well，培養(yǎng)于37°C，5% C02的培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)24h后，將各藥物稀釋為不同濃度，10yL/ well，作用72h。分設(shè)空白組、給藥組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。
[0066] MIT 檢驗(yàn)
[0067] 1)MTT法的基本原理
[0068] 細(xì)胞成活率測(cè)定采用MTT分析法，以活細(xì)胞代謝還原四甲基偶氮唑鹽（3_(4， 5-dimethyl_2thiahiazoyl) _3, 5-di-phenyl-tetrazolium bromide，MTT)為基石出。MTT 為 黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫 酶和細(xì)胞色素C的作用下四氮唑環(huán)開(kāi)裂，生成藍(lán)色的Formazan結(jié)晶。Formazan結(jié)晶的生成 量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比。死細(xì)胞中此酶消失，不能將MTT還原。還原成生成的Formazan 結(jié)晶可在二甲基亞砜（DMS0)中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm出的光密度0D值，0D值的大 小與所生成的Formazan結(jié)晶的量成正比，從而反應(yīng)出藥物對(duì)細(xì)胞成活率的影響。
[0069] 2) MTT法的測(cè)定方法
[0070] 藥物作用72h后，將細(xì)胞與0? 25mg/mL MTT于37°C下共同孵育4h，吸除培養(yǎng)液后 每孔加入100 y L DMS0,完全溶解后使用酶標(biāo)儀于490nm測(cè)定其光密度0D值。最后以空白 組0D值為100%，計(jì)算各組細(xì)胞成活率。
[0071]
[0072] 統(tǒng)計(jì)方法
[0073] 全部資料采用SPSS (13. 0)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行檢驗(yàn)分析。各組數(shù)據(jù)用均值土標(biāo)準(zhǔn)誤 (Mean 土 S. E.)表示，采用One-Way AN0VA評(píng)價(jià)整體性差異，并進(jìn)行Dunnett或Dunnett ' sT3 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。
[0074] 以各濃度所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活抑制率為縱坐標(biāo)Y，給藥濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行 線形回歸，根據(jù)得到的方程求抑制率是50%時(shí)的給藥濃度，即求得該藥物IC50。
[0075] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0076] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：化合物 gypensapogenin H 和 gypensapogenin I 作用于 HepG2 (人 肝癌細(xì)胞株）、A549 (人肺癌細(xì)胞株）和Dul45 (人前列腺癌細(xì)胞株）腫瘤細(xì)胞株72h后對(duì) 3種細(xì)胞株具有一定的殺傷作用，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性?；衔飳?duì)3種細(xì)胞的抑制率與 IC 5。見(jiàn)表 3-5。
[0077] 表3兩個(gè)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2成活的抑制率
[0078]
[0079] 注：#P < 0. 01有顯著性差異，與對(duì)照組比較< 0. 001有顯著性差異。
[0080] 表4兩個(gè)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞A549成活的抑制率
[0081]
[0082] 注：#P < 0. 01有顯著性差異，與對(duì)照組比較< 0. 001有顯著性差異。
[0083] 表5兩個(gè)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞Dul45成活的抑制率
[0084]
[00!?~
[0086] 注：#P < 0. 01有顯著性差異，與對(duì)照組比較< 0. 001有顯著性差異。
[0087] 兩個(gè)化合物對(duì)IfepG2、A549和Dul45腫瘤細(xì)胞株均具有一定殺傷作用。本發(fā)明涉 及到的兩個(gè)化合物對(duì)三種細(xì)胞株具有顯著的細(xì)胞毒活性，并且可能對(duì)其他腫瘤細(xì)胞具有較 好的抑制作用，如H印3B、22R、HeLa等細(xì)胞株，可用于抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 兩個(gè)達(dá)瑪燒型三砲類(lèi)化合物，gypensapogenin H和gypensapogenin I，其結(jié)構(gòu)式如 下2. 如權(quán)利要求1所述的兩個(gè)達(dá)瑪烷型三萜類(lèi)化合物，是通過(guò)酸水解法對(duì)絞股藍(lán)總皂苷 進(jìn)行水解得到的。3. 權(quán)利要求1所述的兩個(gè)達(dá)瑪烷型三萜類(lèi)化合物的制備方法，其特征在于，步驟如下： (1) 選用絞股藍(lán)的干燥全草6000-8000g為原料，用30-95%工業(yè)乙醇回流提取3次，每 次2h，合并提取液，減壓濃縮得乙醇提取物； (2) 將上述乙醇提取物上大孔樹(shù)脂柱，依次用水、70 %乙醇和95%乙醇進(jìn)行洗脫，減壓 回收溶劑后得到70%乙醇洗脫物和95%乙醇洗脫物，其中70%乙醇洗脫物為絞股藍(lán)總皂 苷部分； (3) 對(duì)步驟（2)得到的絞股藍(lán)總皂苷部分進(jìn)行酸水解，即絞股藍(lán)總皂苷溶解于酸性有 機(jī)溶液中進(jìn)行超聲酸水解，然后加水沉淀，水洗得到中性的沉淀； (4) 對(duì)步驟（3)所得的中性沉淀經(jīng)硅膠柱層析，分離后得到gypensapogenin H和 gypensapogenin 1〇4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，所述步驟（1)中3次提取所用的乙醇用量按質(zhì)量計(jì)， 分別為絞股質(zhì)量的8倍、8倍和6倍。5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，所述步驟（2)中的大孔樹(shù)脂柱為HPD100。6. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，所述步驟（4)中的柱層析是采用粒度為100-400目 的硅膠，柱層析的流動(dòng)相為石油醚-丙酮體積比為100 : 1-2 : 1的混合溶劑梯度洗脫，每 250-400mL體積為一個(gè)流分，共收集100-150個(gè)流分，經(jīng)薄層層析硅膠檢識(shí)，合并得到A1-A7 七個(gè)流分；流分A2經(jīng)石油醚-丙酮體積比為10 : 1-2 : 1混合溶劑梯度洗脫，得到A2-1~ A2-6的六個(gè)流分，流分A2-1經(jīng)過(guò)重結(jié)晶得到白色粉末，即化合物gypensapogenin H，流分 A2-2經(jīng)過(guò)重結(jié)晶后得到白色粉末，即化合物gypensapogenin I。7. 權(quán)利要求1所述的兩個(gè)達(dá)瑪烷型三萜類(lèi)化合物用于抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)酸水解法對(duì)絞股藍(lán)總皂苷進(jìn)行水解得到的兩個(gè)達(dá)瑪烷型三萜類(lèi)化合物gypensapogenin？H和gypensapogenin？I，其制備方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，提取純度高，具有較好的抗腫瘤活性，它們對(duì)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的抑制作用均優(yōu)于人參皂苷-Rg3和PPD，gypensapogenin？H和gypensapogenin？I的結(jié)構(gòu)式如下。？
【IPC分類(lèi)】A61K31/58, A61K31/575, C07J73/00, C07J9/00, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105153271
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510624253
【發(fā)明人】史琳, 檀德宏, 孟憲軍
【申請(qǐng)人】沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月17日