一種利那洛肽的純化方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多肽類藥物的純化方法，尤其是一種利那洛肽的純化方法。
【背景技術】
[0002] 利那洛肽（linaclotide)是由美國Ironwood公司研發(fā)的一種鳥苷酸環(huán)化酶 C(GC-C)激動劑，于2012年8月30日獲美國FDA批準上市，商品名為Linzess。該藥為膠 囊劑，用于治療便秘腸易激綜合征（IBS-C)和慢性特發(fā)性便秘（CIC)，它是首個具有此種作 用機制的治療便秘的藥物。
[0003]利那洛肽是一個 14-氨基酸肽，序列為 Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala -Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-〇H( 1-6)，（2-10)，（5-13) _tris (disulfide)，為白色至灰白色無定 形粉末，微溶于水和氯化鈉水溶液（〇. 9%)。
[0004] 利那洛肽是一種鳥苷酸環(huán)化酶C激動劑，它與腸道GC-C結合后，導致細胞內和細 胞外環(huán)鳥苷酸（cGMP)濃度升高。細胞內cGMP升高可以刺激腸液分泌，加快胃腸道移行，從 而增加排便頻率；細胞外cGMP濃度升高會降低痛覺神經的靈敏度、降低腸道疼痛。
[0005] 關于利那洛肽的純化工藝也很少有文獻報道。僅專利申請CN103848893A中提到 了以多孔石墨化碳為固定相，結合流動相中加入一定濃度的Y -環(huán)糊精作立體選擇劑，采 用高效液相色譜法對利那洛肽粗肽進行分離純化。Y _環(huán)糊精帶入純化體系，存在殘留風 險，并且該工藝成本高，不適合工業(yè)化生產。
[0006] 由于多對二硫鍵的存在，給利那洛肽的純化帶來較大困難，體現(xiàn)在：1.在合成利 那洛肽時，產生多種二硫鍵錯配的雜質，這類雜質與產品很難分離，導致最終產品純度低； 2.由于多對二硫鍵的存在，導致利那洛肽分子立體結構上與一般多肽差異很大，常用填料 很難得到純度較好的產品；3.多對二硫鍵在生產的過程中容易產生較多的多聚體，該多聚 體是最主要的雜質之一，本身極不穩(wěn)定，易變色，嚴重影響利那洛肽的色澤、含量及安全性。 本發(fā)明人經研究使用現(xiàn)有技術進行純化發(fā)現(xiàn)，難以將多聚體雜質含量控制在0. 1%以下，同 時容易造成利那洛肽收率降低。
[0007] 本發(fā)明提供了一種利那洛肽的純化工藝，能夠很好地解決上述問題，不僅可以得 到高收率、高純度的利那洛肽，而且能夠很好地將多聚體雜質控制在〇. 1%以下，適合工業(yè) 化生產。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術問題是現(xiàn)有方法純化含有多對二硫鍵的多肽，具體為利那 洛肽，除雜困難，產品總收率低、純度低的問題。
[0009] 通常使用反相高效液相色譜進行多肽純化時，小孔徑的填料的比表面積較大，純 化效果更好。但在實際應用中，我們發(fā)現(xiàn)含有多對二硫鍵的多肽在空間結構上的特殊性，導 致其在小孔徑的填料上所獲得的有效比表面積反而比大孔徑填料的有效比表面積的小，多 聚體雜質不易除去，純化效果不理想。
[0010] 本發(fā)明的技術方案是提供一種利那洛肽的純化方法。該純化方法，使用了一定 范圍內較大孔徑的填料，并在合適的制備條件下對利那洛肽進行了純化。具體表現(xiàn)為， 200-300A孔徑的填料效果好，更進一步得表現(xiàn)為，使用300A孔徑的填料效果更好，尤其是 針對多聚體雜質。
[0011] 本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義； Fmoc :荷甲氧羰基 Fmoc-AA :荷甲氧羰基保護的氨基酸 DIC :N，N'-二異丙基碳化二亞胺 HOBt :1_羥基苯駢三唑 tBu :叔丁基 Trt :三苯甲基 Cys :半胱氨酸 Glu :谷氨酸 Tyr :酪氨酸 Asn :天冬酰胺 Pro :脯氨酸 Ala :丙氨酸 Thr :蘇氨酸 Gly :甘氨酸 DMF :N，f -二甲基甲酰胺 MeOH :甲醇 DCM :二氯甲烷 TFA :三氟醋酸 EDT :乙二硫醇 PhSMe :苯甲硫醚 Piperidine :六氫P比啶 DIEA :N，f -二異丙基乙胺 為此本發(fā)明提供一種利那洛肽的純化方法，其特征包括以下步驟： (1) 使用三氟醋酸調節(jié)利那洛肽粗品溶液pH為3. 5±0. 2 ; (2) 按體積分數(shù)設置梯度，使用50%流動相B沖洗反相填料柱10min，然后用5%流動相 B等度洗脫平衡10min ; (3) 將（1)溶液載入反相填料中； (4) 按體積分數(shù)設置梯度，洗脫梯度的初始狀態(tài)流動相B為5%，保持5分鐘，然后在1分 鐘內將流動相B比例增至16%，然后在80分鐘內將流動相B比例增至26%，收集洗脫餾分； (5) 將洗脫餾分經過轉鹽、濃縮、凍干后得到利那洛肽精肽； 其中，反相填料柱為：（1〇 ym，200~300 A，50 mm X250 mm); 流動相A 3%醋酸水溶液； 流動相B:乙腈； 梯度程序為：洗脫梯度的初始狀態(tài)流動相B為5%，保持5分鐘，然后在1分鐘內將流動 相B比例增至16%，然后在80分鐘內將流動相B比例增至26% ; 流速為：80 mL/min ; 檢測波長為：220 nm〇
[0012] 本發(fā)明提供的方法經過大量試驗篩選，從而獲得較為理想的實驗條件如下： 1. 填料孔徑的選擇 填料孔徑：12〇A、20〇A、30〇A 2. 流動相A類型選擇 0. 1%TFA水溶液、0. 3%醋酸水溶液 3. 填料類型選擇 硅膠C18反相填料、多聚體UniPS_| 10反相填料 針對利那洛肽的純化我們同樣進行了以下5個實驗條件： 實驗條件1 :(1)樣品處理：將利那洛肽粗肽溶液，用TFA調節(jié)pH為3. 5±0. 5 ;(2) 沖柱、平衡：使用50%流動相A沖洗反相填料柱lOmin ;然后用5%流動相A等度洗脫平衡 lOmin;其中，硅膠C18反相填料柱為（10 ym，12〇A，50 _ X250 mm);流動相A:0. 1%TFA水 溶液；流動相B :乙腈；（3)上樣：將樣品溶液載入制備柱中；（4)洗脫：梯度程序為：洗脫 梯度的初始狀態(tài)流動相B為5 %，保持5 min，然后lmin內將流動相B比例增至16 %，再然 后80 min內將流動相B比例增至26% ;流速為：80 mL/min ;檢測波長為220 nm ;中控檢測： 用 Agilent ZORBAX Bonus RP 5um 4.6*250mm色譜柱；以 10mM磷酸二氫鉀磷酸調 pH2.1 為 流動相A，乙腈為流動相B ;流速為1.0ml/min ;柱溫為30 °C;檢測波長為210 nm ;洗脫梯度 的初始狀態(tài)為20 %流動相B，在40 min內將流動相B升至40 %，然后在5 min內將流動 相B升至70 %，在2min內回到初始狀態(tài)，保持13min ; (5)轉鹽、濃縮、凍干后得到利那洛 肽精肽。
[0013] 實驗條件2- 8,實驗操作如實驗條件1所示，各實驗條件及實驗結果如下：
以上結果表明，填料孔徑200A-300A的純化效果好，300A的純化效果最理想。
[0014] 對同樣的利那洛肽粗肽進行了對比實驗，使用現(xiàn)有技術CN103848893A中的純化 工藝和本發(fā)明的較優(yōu)方法分別如實施例4和實施例5所示，本發(fā)明的較優(yōu)方法具有顯著優(yōu) 勢，有關對比實驗結果如下：
本發(fā)明的有益效果是：提供了一種高純度、高收率以及低成本的利那洛肽純化方法，其 中特別可以很好的控制多聚體雜質。
【附圖說明】
[0015] 圖1利那洛肽精肽HPLC譜圖。
[0016] 圖2利那洛肽精肽多聚體檢測譜圖。
[0017] 圖3利那洛肽質譜譜圖。
【具體實施方式】
[0018] 以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。
[0019] 具體地，關于下面實施例中涉及的各商購氨基酸以及氨基酸片段，以及各商購樹 月旨，其生產廠家和商品型號如下： Fmoc保護基氨基酸原料、2-CTC樹脂均為常規(guī)的市售試劑(廠家：吉爾生化(上海）有限 公司；化學純)。
[0020] 有機溶劑和其它原料來源均為市售品（廠家：國藥集團化學試劑有限公司；化學 純)。
[0021] 純化填料：Daisogel SP_2〇〇-l〇-P，Daisogel SP_3〇〇-l〇-P，蘇州納微 UniPS:f) 10。
[0022] 另外，下面實施例中提到的"旋蒸濃縮"以及"凍干"以及測定HPLC和質譜的條件 和所用設備型號及生產廠家說明如下： 制備HPLC :創(chuàng)新通恒、Waters 2545 ; 旋蒸濃縮設備：旋轉蒸發(fā)儀R-200/205 (瑞士 Buchi (布奇）公司）； 旋蒸濃縮條件：30°C下，真空（-0.1 Mpa)條件下旋蒸濃縮，濃縮后體積在旋蒸前總體積 75%以下。
[0023] 凍干設備：凍干機FD-3 (北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）； 凍干條件：將凍干盤放入冰箱冷凍室（-20°C)中，預凍6 h。開啟凍干機，打開制冷， 預冷30 min以上，設置凍干曲線如下： 第一段：在-27 °C運行16 h ;第二段：在-5°C運行4 h ;第三段：在5°C運行2 h ;第四 段：在30°C運行16 h。
[0024] HPLC :Agilent ZORBAX Bonus RP 5um 4. 6*250mm 色譜柱；以 lOmM 磷酸二氫鉀（磷 酸調pH2. 1)為流動相A，乙腈為流動相B ;流速為1.0ml/min ;柱溫為30 °C ;檢測波長為 210 nm ;洗脫梯度的初始狀態(tài)為20 %流動相B，在40 min內將流動相B升至40 %，然后 在5 min內將流動相B升至70 %，在2min內回到初始狀態(tài)，保持13min。
[0025] 凝膠色譜（多聚體檢測）：色譜柱：TSK GEL 2000 SWXL 5ym 7. 8*300mm;流動相： TFA:乙腈：水=0. 05 :35 :65 ;柱溫：30°C;流速：0. 8ml/min ;檢測波長：215nm ;梯度：等度洗 脫30分鐘。
[0026] 實施例1:利那洛肽的固相合成 稱取取代度為1. 50mmol/g的2-CTC樹脂66. 67g，加入到固相反應柱中， 加入到固相反應柱中，用DCM洗滌1次，用DCM溶脹樹脂30分鐘后，取229. 76g Fmoc-Tyr(tBu)-OH(500mmol)用 DMF 溶解，冰水浴下加入 124ml DIEA(750mmol)活化后，加 入上述裝有樹脂的反應柱中，反應2小時后，加入1000ml無水甲醇封閉1小時。用DMF洗滌3 次，得到Fmoc-Tyr (tBu) -CTC樹脂。用DMF:吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護，然 后用 DMF 洗滌 6 次，稱取 175. 72g Fmoc-Cys(Trt)-OH(300mmol)、40. 52g H0Bt(300mmol)加 入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入46ml DIC(300mmol)活化后，加入上 述裝有樹脂的反應柱中，室溫下反應2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無 色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需要再反應1小時，此判斷標準適 用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重復上述脫除Fmoc保護和加入相 應氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照利那洛肽主鏈肽序，依次完成Fm 〇C-Gly-OH、Fm〇C-Thr (tBu) -OH、 Fmoc-Cys(Trt)-〇H、Fmoc_Ala-〇H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt