一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽及其二聚體、以及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽，具體地說，本發(fā)明涉 及一種能夠和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并激活促紅細(xì)胞生成素受體或者能起促紅細(xì)胞生 成素激動作用的促紅細(xì)胞生成素模擬肽二聚體及其制備方法，本發(fā)明還涉及所述模擬肽二 聚體在制備治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EP0)是一種糖蛋白激素，分子量約34kD。血 漿中存在的促紅細(xì)胞生成素由165個氨基酸組成，糖基化程度很高，糖的成分主要是唾液 酸。根據(jù)碳水化合物含量不同，天然存在的促紅細(xì)胞生成素分為兩種類型即a型和0 型，其中，a型含34%的碳水化合物，0型含26%的碳水化合物。兩種類型在生物學(xué)特 性、抗原性及臨床應(yīng)用效果上均相同。人類促紅細(xì)胞生成素基因位于7號染色體長22區(qū)。 1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重組技術(shù)開始大批量生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成 素（recombinant human erythropoietin, rHuEPO)，廣泛用于臨床。應(yīng)用重組 DNA 技術(shù)已 經(jīng)生物合成出促紅細(xì)胞生成素（Egrie，JC，Strickland, TW，Lane，J等（986)免疫生物學(xué) (Immun〇bi〇l)72:213-224)，其是插入到中國倉鼠的卵巢組織細(xì)胞（CH0細(xì)胞）中并且表達(dá) 的克隆的人促紅細(xì)胞生成素基因的產(chǎn)物。天然存在的人促紅細(xì)胞生成素首先翻譯成含有 166個氨基酸并且166位是精氨酸的多肽鏈。在翻譯后修飾中，用羥肽酶裂解掉166位精氨 酸。沒有糖基的人EP0的多肽鏈的分子量是18236Da，在完整的促紅細(xì)胞生成素分子中，糖 基占整個分子量的大約40% (J. Biol. Chem. 262:12059)。
[0003] 促紅細(xì)胞生成素是最早應(yīng)用于臨床的細(xì)胞因子，是迄今所知作用最單一、且安全 可靠的升血紅蛋白制劑。對于腎貧血、再生障礙性貧血、多發(fā)性骨髓瘤及陣發(fā)性夜間血尿等 均有一定療效；此外，應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素還可減少手術(shù)中的輸血量，并能在一定程度上 糾正由惡性腫瘤、化療及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的貧血。由于促紅細(xì)胞生成素主要由腎小管 內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，腎性疾患引起的貧血是促紅細(xì)胞生成素的首選適應(yīng)證；促紅細(xì)胞生成素糾 正腎性貧血的療效幾乎100%，但并不能改善腎功能。促紅細(xì)胞生成素的治療安全、有效，適 合長期治療，也能避免血源緊張。在2006年的全球生物技術(shù)藥市場上，促紅細(xì)胞生成素類 的重組藥物占了 119億美元，有巨大的市場容量。
[0004] 早在1989年，美國FDA就正式批準(zhǔn)重組人促紅素（EP0GEN)用于腎性貧血的治療， 但直到1992年才在我國上市。我國慢性腎炎的年發(fā)病率約為0. 25%，其中相當(dāng)一部分患者 最終會轉(zhuǎn)為腎衰，每年的腎性貧血患者約50-60萬。根據(jù)保守的用藥量估算，如果按當(dāng)前的 價格30-40元/支，加上癌癥相關(guān)性貧血等其他病人的用藥，國內(nèi)市場容量約12-16億元甚 至更大（病人平均體重按50Kg計算）。自20世紀(jì)90年代后期，促紅細(xì)胞生成素已進(jìn)入我 國重點(diǎn)城市醫(yī)院暢銷藥品行列，2003年在全國重點(diǎn)城市樣本醫(yī)院用藥金額6213萬元，排名 第56位。2004年，全國重點(diǎn)城市樣本醫(yī)院購藥金額增長到8049萬元，同比增長了 30%。
[0005] 促紅細(xì)胞生成素作為一種作用于骨髓造血細(xì)胞，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增生、分化，最終 成熟的內(nèi)分泌激素，對機(jī)體供氧狀況發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在胚胎早期，促紅細(xì)胞生成素由 肝生成，然后逐漸向腎轉(zhuǎn)移，出生后主要由腎小管間質(zhì)細(xì)胞分泌。
[0006] 在促紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)紅組細(xì)胞分化過程中，球蛋白被誘導(dǎo)，這能使細(xì)胞吸收更 多的鐵合成功能性的血紅蛋白，這種功能性的血紅蛋白可以和成熟的紅血球中的氧結(jié)合， 因此，紅血球和血紅蛋白在提供機(jī)體氧方面扮演了極其重要的角色。這一過程是由促紅細(xì) 胞生成素與紅組細(xì)胞的表面受體之間的相互作用引起的。
[0007] 當(dāng)人體處于健康狀態(tài)時，組織可以從已經(jīng)存在的紅血球中吸收足夠多的氧，此時 體內(nèi)的促紅細(xì)胞生成素濃度很低，這種正常的較低的促紅細(xì)胞生成素濃度完全可以刺激促 進(jìn)由于年齡的問題而正常損失的紅細(xì)胞。當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)中的依靠紅細(xì)胞進(jìn)行氧輸送的水平被 降低進(jìn)而出現(xiàn)缺氧情況時，促紅細(xì)胞生成素在體內(nèi)的數(shù)量將會增加，機(jī)體缺氧狀態(tài)可以由 以下原因引起的：過量的輻射、因高煒度或長期昏迷造成的氧攝入量減少、各種類型的貧血 等等。作為對組織處于缺氧壓力的應(yīng)答，促紅細(xì)胞生成素水平的提高可以刺激紅組細(xì)胞的 分化達(dá)到提高紅細(xì)胞生成的能力。當(dāng)體內(nèi)的紅細(xì)胞的數(shù)量大于正常組織的需求時，循環(huán)系 統(tǒng)中促紅細(xì)胞生成素的水平被降低。正是由于促紅細(xì)胞生成素對于紅細(xì)胞的生成有著至關(guān) 重要的作用，因此這類激素對于治療和診斷以紅細(xì)胞生成低下和缺陷為特征的血液病方面 有著很廣泛的前景。最近的研究為推測促紅細(xì)胞生成素療法在多種疾病、紊亂和血液學(xué)異 常情況中的效用提供了基礎(chǔ)，這些疾病包括：慢性腎衰竭（CRF)患者貧血癥的治療中使用 促紅細(xì)胞生成素和在艾滋病和接受化療的癌癥患者貧血癥的治療中使用促紅細(xì)胞生成素 (Danna, RP，Rudnick，SA，Abels，RI，于：MB，Garnick編著，臨床應(yīng)用中的促紅細(xì)胞生成素一 國際展望（Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. Marcel Dekker ; 1990:p301_324)。
[0008] 促紅細(xì)胞生成素的部分生物學(xué)效應(yīng)可以通過和細(xì)胞膜表面的受體內(nèi)在作用來 調(diào)節(jié)。起先，使用從小鼠的脾臟里分離出的未成熟的紅細(xì)胞來研究細(xì)胞表面結(jié)合的促 紅細(xì)胞生成素蛋白時發(fā)現(xiàn)，這種蛋白是由兩種多聚肽組成，其分子量大約為85000~ 100000KD (Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3690-3694)由比較詳細(xì)的 敘述。促紅細(xì)胞生成素的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目也被計算出來了，大約每個細(xì)胞膜含有800~ 1000個位點(diǎn)。在這些結(jié)合位點(diǎn)中大約有300個結(jié)合位點(diǎn)的Kd水平為90pM，而剩下的結(jié)合 位點(diǎn)的結(jié)合力比較弱，大約有570pM。有研究表明從感染了 friend病毒貧血株的小鼠的脾 臟紅細(xì)胞對EP0的響應(yīng)情況發(fā)現(xiàn)，大約有400個結(jié)合位點(diǎn)，其中Kd水平高的為100pM，Kd水 平低的為800pM。
[0009] 隨后的工作就是兩種促紅細(xì)胞生成素受體被單個基因翻錄，這個基因已經(jīng)被克 隆。例如，小鼠和人的促紅細(xì)胞生成素受體的DNA序列以及編碼肽的序列在W090/08822中 已經(jīng)有敘述。目前的模型表明促紅細(xì)胞生成素結(jié)合到促紅細(xì)胞生成素受體導(dǎo)致了兩個促紅 細(xì)胞生成素受體的活化和二聚，這種二聚進(jìn)一步導(dǎo)致了信號傳導(dǎo)的開始。
[0010] 促紅細(xì)胞生成素克隆基因的應(yīng)用更有助于幫助尋找這些重要受體的激動劑和拮 抗劑。某種程度上能夠作用促紅細(xì)胞生成素受體的肽已經(jīng)被確定和敘述。特別是確定了一 組含有主要肽段的肽，這些肽可以和促紅細(xì)胞