透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物包被的單精子選擇裝置及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及體外精子挑選領(lǐng)域，是一種透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物包被的單精子選擇裝置及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)在用于挑選精子的培養(yǎng)皿多為普通細(xì)胞培養(yǎng)皿(Petri dish)，將處理后的精液放入普通細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下觀察精子的活動(dòng)性能，操作者需要在眾多的精子中根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)判斷并挑選出被認(rèn)為高質(zhì)量的成熟精子，眾所周知，活動(dòng)性較強(qiáng)的精子不一定是成熟的精子，此挑選過程受操作者個(gè)人經(jīng)驗(yàn)與主觀性影響較大，具有明顯的隨機(jī)性，不能確保挑選出的活躍精子即為成熟的活力精子。
[0003]透明質(zhì)酸是卵子和透明帶黏液基質(zhì)的主要成分，精子頂體和胞質(zhì)膜中含有透明質(zhì)酸酶。當(dāng)精子穿透卵冠丘復(fù)合體時(shí)，胞質(zhì)膜中透明質(zhì)酸酶水解卵冠丘復(fù)合體中的黏液透明質(zhì)酸，從而穿過黏液；在透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)時(shí)精子釋放透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸，在整個(gè)過程中，精子與透明質(zhì)酸結(jié)合起到了重要作用。有研究表明只有成熟的活動(dòng)精子可以與透明質(zhì)酸結(jié)合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種節(jié)約時(shí)間、既能準(zhǔn)確選擇出成熟的精子又不破壞精子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與活力的透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物包被的單精子選擇裝置及應(yīng)用。
[0005]為了解決以上所述的技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:一種透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物包被的單精子選擇裝置，包括皿體和適配的皿蓋，在所述皿體內(nèi)底部一體制成有小凹槽，小凹槽中包被有可結(jié)合成熟精子的透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物，小凹槽的高度高于所述包被的透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物的高度；皿體的外壁分布有若干個(gè)方便拿取皿體且能避免接觸皿體皿口的小耳；所述皿體的底部下表面設(shè)有避免皿體底部磨損的凸臺(tái)階；培養(yǎng)皿體的邊緣最高處與小凹槽的底部形成的夾角為5?23度。
[0006]優(yōu)選地，所述小凹槽由自所述培養(yǎng)皿體底部向上一體形成的一個(gè)環(huán)形突起形成。
[0007]優(yōu)選地，所述小凹槽設(shè)置在所述培養(yǎng)皿體底部的中心位置。
[0008]進(jìn)一步地，所述小凹槽的尺寸為:直徑9mm，高度0.6mm。
[0009]更進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)皿體的尺寸為:直徑50mm，高度8mm。
[0010]所述皿蓋和皿體由透明硬質(zhì)塑料制成。
[0011]—種所述的透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物包被的單精子選擇裝置的使用方法，
[0012]I)將所述單精子選擇裝置從2_8°C環(huán)境中取出，平衡至室溫；
[0013]2)分離并洗滌精子，以含有3?5mg/ml人白蛋白的培養(yǎng)液調(diào)節(jié)得到精子數(shù)量為0.2?IXO6個(gè)/ml的精子懸液，提高精子被透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物特異性結(jié)合的識(shí)別準(zhǔn)確性；
[0014]3)揭下所述培養(yǎng)皿蓋，在所述單精子選擇裝置的皿體內(nèi)準(zhǔn)備若干個(gè)培養(yǎng)液液滴用于接收挑選后的成熟精子；
[0015]4)吸取20?30ul經(jīng)所述2)處理后的精子懸液至該單精子選擇裝置的小凹槽中，使精子懸液布滿小凹槽；
[0016]5)蓋上所述培養(yǎng)皿蓋，22?30°C反應(yīng)I?1min ；
[0017]6)揭下所述培養(yǎng)皿蓋，在顯微鏡下確定精子頭部被小凹槽內(nèi)透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物包被的物質(zhì)結(jié)合至固相表面難以運(yùn)動(dòng)，但尾部鞭打劇烈的精子；
[0018]7)用精子注射用穿刺針或其他中空細(xì)管，緊靠培養(yǎng)皿體的側(cè)壁或以與小凹槽底部小于或等于23度的角度將所述步驟6)中確定的精子挑選出并放置于所述培養(yǎng)液滴中。
[0019]—種所述的透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物包被的單精子選擇裝置的使用方法，
[0020]I)將所述單精子選擇裝置從2_8°C環(huán)境中取出，平衡至室溫；
[0021]2)分離并洗滌精子，以含有3?5mg/ml人白蛋白的培養(yǎng)液調(diào)節(jié)得到精子數(shù)量為0.2?IXO6個(gè)/ml的精子懸液，提高精子被透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物特異性結(jié)合的識(shí)別準(zhǔn)確性；
[0022]3)揭下所述培養(yǎng)皿蓋，在所述單精子選擇裝置培養(yǎng)皿體內(nèi)準(zhǔn)備若干個(gè)暫存挑選出的精子的培養(yǎng)液液滴以及抑制挑選出的精子運(yùn)動(dòng)的PVP液滴；
[0023]4)吸取20?30ul經(jīng)所述2)處理后的精子懸液至該單精子選擇裝置的小凹槽
(21)中，使精子懸液布滿小凹槽；
[0024]5)蓋上所述培養(yǎng)皿蓋在顯微鏡熱臺(tái)加熱至33?37°C反應(yīng)I?1min ；
[0025]6)揭下所述培養(yǎng)皿蓋，在顯微鏡下確定精子頭部被小凹槽內(nèi)透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物包被的物質(zhì)結(jié)合至固相表面難以前向運(yùn)動(dòng)，但尾部鞭打劇烈的精子；
[0026]7)用精子注射用穿刺針或其他中空細(xì)管，緊靠培養(yǎng)皿體2的側(cè)壁或以與小凹槽底部小于或等于23度的角度將所述步驟6)中確定的精子挑選出，暫存于培養(yǎng)液液滴或放置于PVP液滴中制動(dòng)。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，能結(jié)合成熟精子的透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物直接包被成固相于所述小凹槽中，省略了操作者每次包被透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物的過程，操作簡(jiǎn)單快捷，極大節(jié)約操作者時(shí)間、提高工作效率；通過對(duì)大量被挑選的精子進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)挑選精子的角度小于23度時(shí)，能確保被挑選的精子不受任何損傷且在挑起的過程中不易掉落，本發(fā)明對(duì)培養(yǎng)皿體深度與直徑的進(jìn)行最優(yōu)化試驗(yàn)，保證操作者緊靠培養(yǎng)皿體2的側(cè)壁挑選精子時(shí)，挑選工具與小凹槽底部的夾角小于23度；培養(yǎng)皿體的外壁分布有若干個(gè)小耳，既方便操作者拿取培養(yǎng)皿體，又能有效杜絕操作者接觸到培養(yǎng)皿體的皿口，防止外來污染物落入培養(yǎng)皿體中，影響精子的挑選；進(jìn)一步地，培養(yǎng)皿體的外面底部設(shè)有凸臺(tái)階，有效避免培養(yǎng)皿體的下表面受到磨損、刮花，干擾顯微鏡下精子的挑選工作，本發(fā)明同時(shí)還提供了該透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物包被的單精子選擇裝置的使用方法。使用本發(fā)明挑選成熟的單精子，既節(jié)約操作者時(shí)間，又能在不破壞精子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與活力的狀態(tài)下準(zhǔn)確選擇出成熟的單精子。
【附圖說明】
[0028]圖1是培養(yǎng)皿蓋立體示意圖
[0029]圖2是培養(yǎng)皿體立體示意圖
[0030]圖3是培養(yǎng)皿體底部立體示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1
[0032]一種透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物包被的單精子選擇裝置，包括皿體2和適配的皿蓋I，優(yōu)選采用透明硬質(zhì)塑料制成；所述培養(yǎng)皿體2的尺寸為:直徑50_，高度8_，所述皿體2的內(nèi)底部中心位置一體制成有一個(gè)向上的環(huán)形凸起形成所述小凹槽21，小凹槽21的高度高于所述包被的固相透明質(zhì)酸的高度，小凹槽21中包被有可結(jié)合成熟精子的固相透明質(zhì)酸。也可以將小凹槽21設(shè)置于皿體2內(nèi)部底部的其他合適位置，小凹槽21可采用同樣可以結(jié)合成熟精子頭部的固相透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物來包被。
[0033]所述小凹槽21的尺寸優(yōu)選為:直徑9mm，高度0.6mm，根據(jù)三角函數(shù)，當(dāng)操作者緊靠培養(yǎng)皿體2的側(cè)壁從小凹槽21中挑選精子時(shí)的角度約為18度，經(jīng)過多次試驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)挑選成熟精子的角度大于23度時(shí)，存在以下三方面的缺陷:第一，由于角度較大，精子注射用穿刺針或其他中空細(xì)管頂端尖頭的部位容易損傷被挑選的精子；第二，由于角度過大，在重力作用下，被挑選的成熟精子容易從精子注射用穿刺針或其他中空細(xì)管中掉落；第三，精子注射用穿刺針或其他中空細(xì)管頂端尖頭的位置容易刮花培養(yǎng)皿體2，造成干擾，增加操作者在顯微鏡下確認(rèn)及挑選成熟精子的難度。培養(yǎng)皿體2和小凹槽21的尺寸也可以根據(jù)需要采取其他尺寸，只要保證操作者緊靠培養(yǎng)皿體2的側(cè)壁從小凹槽21中挑選精子的角度小于23度，確保被挑選精子可以完整無損傷挑出即可。充分考慮培養(yǎng)皿體2的高度與直徑的關(guān)系，優(yōu)選培養(yǎng)皿體2的側(cè)壁上沿與小凹槽21底部之間的夾角為5?23度。
[0034]皿體2的外面?zhèn)缺谧詈镁鶆蚍植加?個(gè)方便拿取皿體2的小耳22，使用的時(shí)候，操作者可以用拇指和食指拿起小耳22，有效避免手指或手套接觸皿口，杜絕外來污染物落入皿體中妨礙精子的挑選；皿體2的底部下表面優(yōu)選設(shè)有3個(gè)避免皿體2底部磨損的凸臺(tái)階23，保證在顯微鏡下精子的挑選工作。所述小耳22和凸臺(tái)階23的個(gè)數(shù)均可根據(jù)實(shí)際設(shè)置若干個(gè)。
[0035]通常將該固相透明質(zhì)酸包被的單精子選擇裝置優(yōu)選在在4°C冰箱環(huán)境下保存，也可以將其保存在可以在2_8°C的環(huán)境下，只要能保證固相透明質(zhì)酸及其鹽或衍生物保持可