一株高產(chǎn)細(xì)胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株高產(chǎn)細(xì)胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌及 其在制備抗高血壓的發(fā)酵乳品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌是公認(rèn)的安全級微生物，廣泛應(yīng)用于乳制品的發(fā)酵。牛乳是一種富含酪蛋 白而缺少游離氨基酸的環(huán)境，一些乳酸菌菌株為了適應(yīng)運種特殊的生長環(huán)境，進(jìn)化出一套 完整的蛋白酶系統(tǒng)，用來水解酪蛋白獲得游離的氨基酸W供菌體生長使用。運種蛋白酶系 統(tǒng)包括S個主要組分：細(xì)胞被膜蛋白酶（Cell化velopeProteinase,CE巧，寡膚轉(zhuǎn)運系統(tǒng) 和細(xì)胞內(nèi)膚酶。其中，細(xì)胞被膜蛋白酶是催化水解酪蛋白的第一步，在整個蛋白酶系統(tǒng)中具 有核屯、作用，該酶在細(xì)胞內(nèi)合成，經(jīng)過分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至胞外并且錯定在菌體細(xì)胞壁上。細(xì)胞 被膜蛋白酶可W將牛乳中的酪蛋白降解為寡膚，寡膚再經(jīng)由轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被膚酶降 解為游離的氨基酸。乳酸菌細(xì)胞被膜蛋白酶的合成受到培養(yǎng)基中氮源的調(diào)控，當(dāng)培養(yǎng)基中 游離氨基酸豐富時，其合成被抑制，而當(dāng)游離氨基酸非常貧乏時，細(xì)胞被膜蛋白酶將大量合 成。牛乳恰好是運種游離氨基酸貧乏的環(huán)境，可W刺激特定菌株合成大量的細(xì)胞被膜蛋白 酶。
[0003] 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-convertingenzyme,ACE)可W將無活性的十膚 血管緊張素I轉(zhuǎn)變成血管收縮劑八膚血管緊張素II，同時使血管舒張九膚失活，進(jìn)而使血 壓升高。通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性可W達(dá)到抗高血壓的效果。近期研究表明，來 源于牛乳的短膚具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，進(jìn)而達(dá)到抗高血壓的效果，運種短膚 被稱為生物活性膚。
[0004] 利用具有細(xì)胞被膜蛋白酶活性的乳酸菌菌株發(fā)酵牛乳是獲得生物活性膚的一種 經(jīng)濟(jì)適用的方法。 陽0化]鼠李糖乳桿菌是一類較早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用的益生型乳酸菌，如上世紀(jì)80年代由美國 科學(xué)家從健康人腸道中分離的鼠李糖乳桿菌LGG，該菌株能夠耐受消化道環(huán)境，并在腸道內(nèi) 定殖，起到調(diào)節(jié)腸道菌群，預(yù)防和治療腹瀉，提高機(jī)體免疫力等作用。近年來，國內(nèi)外對于鼠 李糖乳桿菌的研究主要集中于該菌株定殖于腸道細(xì)胞的粘附機(jī)制及其對免疫系統(tǒng)的調(diào)控。
[0006]目前，國外已發(fā)表的產(chǎn)生細(xì)胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌有分離自人陰道的鼠李 糖乳桿菌BGT10,然而因其分離生境的特定性，限制了該菌株的在食品領(lǐng)域的應(yīng)用；此外報 道了一株產(chǎn)生細(xì)胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌CECT287,其發(fā)酵牛乳72小時后產(chǎn)物對血管 緊張素轉(zhuǎn)化酶活性最高抑制能力為47%，但由于該菌株發(fā)酵周期長且血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活 性抑制能力居中，從而對于該菌株應(yīng)用于生產(chǎn)具有抗高血壓的益生型發(fā)酵乳制品造成了一 定的阻礙?；诖?，研發(fā)或篩選具有細(xì)胞被膜蛋白酶酶活力高，發(fā)酵周期短，產(chǎn)物對于血管 緊張素轉(zhuǎn)化酶活性抑制能力強(qiáng)的鼠李糖乳桿菌成為亟待解決的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)所述的鼠李糖乳桿菌細(xì)胞被膜蛋白酶酶活力較低，發(fā)酵周期長，產(chǎn) 物對于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性抑制能力較弱的問題，本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)細(xì)胞被 膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌及其在制備抗高血壓的發(fā)酵乳品中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所述的高產(chǎn)細(xì)胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌，其特征在于：所述菌株命名 為鼠李糖乳桿菌化actobacillus;rhamnosus)Rl，該菌株已于2015年07月6日保藏在"中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、"，保藏號為CGMCCNo. 11055。
[0009] 上述鼠李糖乳桿菌化actobacillus;rhamnosus)Rl分離自新疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中， 是一株能夠在特定的化學(xué)合成培養(yǎng)基或原料乳中產(chǎn)生細(xì)胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌，具 有鼠李糖乳桿菌的典型特征，即為：革蘭氏陽性，兼性厭氧，無芽抱，不運動；菌落較小且大 小均一，邊緣整齊；細(xì)胞呈短桿狀，常3-5個成鏈；其生理生化特征是：過氧化氨酶陰性，VP 反應(yīng)陰性，嗎I噪反應(yīng)陰性，上述鼠李糖乳桿菌CGMCCNo. 11055的生理生化特征詳見表1。
[0010] 表1鼠李糖乳桿菌CGMCCNo. 11055的生理生化特征
[0011]
[0012]
[0013] 上述鼠李糖乳桿菌化actobaciIlus rhamnosus)RlCGMCC No.11055 生長溫度為 25-42°C，最適生長溫度為37°C。
[0014] 上述鼠李糖乳桿菌化actobacillusrhamnosus)RlCGMCCNo. 11055 在MRS培養(yǎng)基 中生長，靜置培養(yǎng)12小時后，菌體密度達(dá)到5. 32,抑值為4. 34。
[001引上述MRS培養(yǎng)基的配方：膜蛋白腺10.Og,牛肉膏10.Og,酵母粉5g，葡萄糖20.Og, 巧樣酸S錠2.Og,硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 25g，乙酸鋼3. 12g，憐酸氨二鋼1. 63g，乙酸鐘 2. 25g，吐溫-801.OmL,蒸饋水 1000血，115°C滅菌 30min。
[0016] 通過在美國生物工程信息中屯、（化tionalCenterforBiotechnology In化rmation，NCBI)查閱國際相關(guān)的基因庫，將本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌化actobacillus rhamnosus)RlCGMCCNo. 1105516SrDNA基因序列與有關(guān)菌株的16SrDNA基因序列比較，雖 有相似性（如表2所示），但卻不完全相同，說明本發(fā)明的菌株是首次分離鑒定，具有原創(chuàng) 性。
[0017] 表 2 鼠李糖乳桿菌（Xactobacillus rhamnosus)R1CGMCCNo.11055 的
[0018] 16SrDNA序列與GenBank提交菌株序列相似性比較
[0019]
[0020] 上述鼠李糖乳桿菌(Xactobacillus rhamnosus)R1CGMCCNo.11055在化學(xué)合成培 養(yǎng)基中37°C靜置培養(yǎng)24小時，菌體密度可達(dá)到2. 85,抑值降至3. 95。檢測細(xì)胞被膜蛋白 酶酶活最高達(dá)到200個酶活單位每毫克蛋白。
[0021] 上述化學(xué)合成培養(yǎng)基配方為：葡萄糖lOg/l，乙酸鋼5g/l，憐酸二氨鐘3g/l，憐 酸氨二鐘3g/L，屯水硫酸儀0. 2g/l，四水硫酸儘0. 05g/l，屯水硫酸亞鐵0. 02g/l，丙氨酸 0.Ig/L精氨酸0.IgA,天冬氨酸0. 2g/l，天冬酷胺0. 2g/l，半脫氨酸0. 2g/l，谷氨酷胺 0. 2g/l，谷氨酸0. 2g/l，甘氨酸0.Ig/l，組氨酸0.Ig/l，異亮氨酸0.Ig/l，亮氨酸0.Ig/L， 賴氨酸0.Ig/L，苯丙氨酸0.Ig/l，甲硫氨酸0.Ig/l，脯氨酸0.Ig/L，絲氨酸0.Ig/L，蘇氨酸 0.Ig/l，酪氨酸0.Ig/L，色氨酸0.Ig/l，鄉(xiāng)氨酸0.Ig/l，對氨基苯甲酸0.Olg/!,D-生物素 0. 01g/l，VBl0. 001g/l，VB6 0. 002g/l，VB3 0. 001g/l，VB5 0.OOlg/l，葉酸 0. 001g/L，VB12 0.OOlg/l，VB2 0.OOlg/l，腺嚷嶺0.01邑/1，鳥嚷嶺0.01邑/1，尿喀晚0.01邑/1，黃嚷嶺0.01邑/ L，胸腺喀晚0.Olg/L，吐溫801.Oml/L，自然抑值，115°C滅菌30分鐘。
[0022] 本發(fā)明所述的高產(chǎn)細(xì)胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌在制備抗高血壓的發(fā)酵乳品 中的應(yīng)用。
[0023] 上述鼠李糖乳桿菌化actobacillusrhamnosus)Rl在化學(xué)合成培養(yǎng)基或牛乳基質(zhì) 中生長能產(chǎn)生細(xì)胞被膜蛋白酶，將其W體積比為2%~4%的量接種于原料乳中，37°C發(fā)酵 12~14小時即獲得活菌數(shù)為巧~6)Xl〇9CFU/mL的具有抗高血壓的發(fā)酵乳品。
[0024] 上述原料乳優(yōu)選鮮牛乳，鮮牛乳采用己氏消毒法，在85°C保溫15秒。
[0025] 本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)細(xì)胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌，有效解決了目前的細(xì)胞 被膜蛋白酶酶活力較低，發(fā)酵周期長，產(chǎn)物對于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性抑制能力較弱的問 題，同時利用其制備的發(fā)酵乳又為現(xiàn)有生活提供了一種高效抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的 發(fā)酵乳品，實驗證實該菌株發(fā)酵原料乳12至14小時后，對于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性抑制率 可達(dá)63. 1%至69. 5%之間，預(yù)示本發(fā)明所述鼠李糖乳桿菌菌株在生產(chǎn)抗高血壓功效的發(fā) 酵乳品方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0026] 本發(fā)明所述的高產(chǎn)細(xì)胞被膜蛋白酶的鼠李糖乳桿菌已于2015年07月6日保藏在 "中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號）"，保藏號為CGMCCNo. 11055。
[0027] 圖 1 鼠李糖乳桿菌(Xactobacillusrhamnosus)R1CGMCCNo. 11055 在化學(xué)合成培 養(yǎng)基中37°C靜置培養(yǎng)24小時內(nèi)，菌體細(xì)胞密度（0D600)和產(chǎn)生細(xì)胞被膜蛋白酶（CE巧的曲 線。
【具體實施方式】
[0028] 實施例 1 :鼠李糖乳桿菌化actobacillusrhamnosus)R1CGMCCNo. 11055 菌株的 篩選及生理生化特性
[0029] 將新疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶樣品涂布在MRS培養(yǎng)基瓊脂平板上，倒置平板37 °C培養(yǎng)24小 時，挑取白色圓形且過氧化氨酶陰性的菌落，鏡檢為短桿菌，反復(fù)劃線確定純菌落，接種到 MRS培養(yǎng)基，顯微觀察個體形態(tài)及進(jìn)行生化反應(yīng)測定，最終篩選得到一株鼠李糖乳桿菌，命 名為鼠李糖乳桿菌（Xactobacillusrhamnosus)Rlo
[0030] 上述鼠李糖乳桿菌化actobacillusrhamnosus)Rl菌株為革蘭氏陽性菌，兼性厭 氧，無芽抱，不運動；菌落較小且大小均一，邊緣整齊；細(xì)胞呈短桿狀，常3-5個成鏈；其生理 生化特征是：過氧化氨酶陰性，VP反應(yīng)陰性，嗎I噪反應(yīng)陰性，可利用乳糖、葡萄糖、山梨糖、 薦糖、