一種用于病毒分離培養(yǎng)和增殖的細(xì)胞株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于畜牧類生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的講是一種用于病毒培養(yǎng)和增殖的細(xì)胞 株。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳代細(xì)胞應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)，經(jīng)過多年的研究與嘗試，排除了致腫瘤性等不安全因 素，終于在1984年得到了國際上的普遍承認(rèn)。在傳代細(xì)胞系中，運(yùn)用最廣泛的是Vero細(xì)胞 (非洲綠猴腎細(xì)胞），流感病毒，狂犬病毒，乙型腦炎病毒等病毒疫苗均可W使用Vero細(xì)胞 進(jìn)行生產(chǎn)，同時(shí)該細(xì)胞也是腸道病毒71，腦脊髓炎病毒等病毒疫苗生產(chǎn)的候選細(xì)胞。
[0003] 在畜禽用病毒疫苗的生產(chǎn)中，仍然有很大一部分疫苗是利用動(dòng)物組織、禽胚或是 原代細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，其制造工藝復(fù)雜落后，生產(chǎn)成本過高，生產(chǎn)效率低下，同時(shí)生產(chǎn)所用的 動(dòng)物組織等原材料來源、品種不一致使疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定，并且還存在攜帶其他病原的潛在 危險(xiǎn)。因此尋找適用于畜禽病毒增殖的安全、穩(wěn)定、高效傳代細(xì)胞系對(duì)疫苗生產(chǎn)具有重要的 現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于畜禽類病毒增 殖的細(xì)胞株，該細(xì)胞株對(duì)于多種畜禽病毒敏感且穩(wěn)定，并能持續(xù)穩(wěn)定增殖，該細(xì)胞株無支 原體、細(xì)菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在致瘤風(fēng)險(xiǎn)，安全性高。 陽〇化]本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 本發(fā)明提供了一種用于畜禽病毒培養(yǎng)的細(xì)胞株，其中，細(xì)胞株為非洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO株（AfricangreenmonkeykidneycelllinestrainVeroBlO),其保藏編號(hào) 為：CGMCCNo. 9705,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏日期為 2014年09月24日。
[0006] 本發(fā)明中，所用術(shù)語"非洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO株"是指從非洲綠猴腎細(xì)胞系 Vero母細(xì)胞克隆獲得的新細(xì)胞株，也稱為VeroBlO細(xì)胞，簡稱VeroBlOo
[0007] 本發(fā)明中，所述非洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO株具有W下特征：細(xì)胞貼壁良好、形態(tài) 飽滿、界限清晰，表面光滑，VeroBlO株較Vero母細(xì)胞細(xì)胞之間的界限更明顯、整齊，細(xì)胞折 光性強(qiáng)，胞質(zhì)飽滿，核質(zhì)清晰。
[0008] 本發(fā)明所述的一種用于病毒分離培養(yǎng)和增值的細(xì)胞株的選育方法，其包括如下步 驟： Vero細(xì)胞有限稀釋法克隆培養(yǎng)和病毒敏感Vero細(xì)胞株的篩選。
[0009] 具體步驟為： (1)Vero細(xì)胞有限稀釋法克隆培養(yǎng) 將Vero細(xì)胞傳代第5代，經(jīng)檢驗(yàn)無支原體、細(xì)菌、真菌、外源病毒污染后，用0. 25%膜蛋 白酶消化制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋， 然后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入于37°C5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)15d，挑選有單個(gè)細(xì)胞生長 的細(xì)胞孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板培養(yǎng)，并依次將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得亞克隆細(xì)胞株。
[0010] (2)病毒敏感Vero細(xì)胞株的篩選 挑選細(xì)胞狀態(tài)好的幾株亞克隆細(xì)胞分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞長滿單層， 使用山羊痘病毒AV41株進(jìn)行接種，于37°C5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，并W未接 毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，挑選病變最明顯的Vero細(xì)胞株進(jìn)行傳代，經(jīng)=次連續(xù)篩選后，獲 得1株敏感性最高的細(xì)胞克隆株，命名為VeroBlO株，即非洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO株，并 用液氮保存。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的非洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO株形態(tài)均一，生長性能好，生長曲線呈 "S"型，細(xì)胞形態(tài)和生長速度穩(wěn)定，生長周期長，可連續(xù)傳代，在連續(xù)傳代過程中，經(jīng)檢測，非 洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO株沒有細(xì)菌、真菌、支原體W及常見的幾種交叉感染病毒等外源 污染，并且不存在致瘤風(fēng)險(xiǎn)，安全性高。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用本發(fā)明所述的細(xì)胞株培養(yǎng)病毒的方法，其包括： 將非洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO株接種于培養(yǎng)瓶，于37°C5%C02條件下4化可W長成 致密單層，接種病毒的病毒液0.5血，加入含2%胎牛血清的DMEM維持液，于37°C5%0)2 條件下培養(yǎng)；逐日觀察細(xì)胞病變細(xì)胞病變達(dá)到80%W上時(shí)收獲病毒，同樣方法連續(xù)傳=代， W確定病變穩(wěn)定出現(xiàn)。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，所述可增殖的病毒包括山羊痘病毒、犬?dāng)z熱病毒、黃病毒、小碟攝病 O
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：該非洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO在接種山羊痘病毒AV41株， 犬?dāng)z熱病毒CDV-Iv化株，黃病毒FPV-Xinyu株，小碟攝病毒SYG26-35株后，細(xì)胞分別出現(xiàn) 了不同特征的病變，非洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO株較之Vero母細(xì)胞更有利于四種病毒的 復(fù)制與增殖，因此，采用該細(xì)胞株進(jìn)行病毒分離增殖培養(yǎng)有利于開展有關(guān)山羊痘病毒、犬?dāng)z 熱病毒、黃病毒、小碟攝病毒的病原研究與疫苗防制，而且細(xì)胞株對(duì)于多種畜禽病毒敏感且 穩(wěn)定，并能持續(xù)穩(wěn)定增殖，該細(xì)胞株無支原體、細(xì)菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在致 瘤風(fēng)險(xiǎn)，安全性高具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0015] 圖1為實(shí)施例2中正常VeroBlO細(xì)胞株形態(tài)圖； 圖2為實(shí)施例2中VeroBlO細(xì)胞和母本Vero的生長曲線圖； 圖3為實(shí)施例3中接種山羊痘病毒AV41株后病變圖片； 圖4為實(shí)施例4中接種犬?dāng)z熱病毒CDV-Iv化株株后病變圖片； 圖5為實(shí)施例5中接種黃病毒FPV-Xinyu株株后病變圖片； 圖6為實(shí)施例6中接種小碟攝病毒SYG26 - 35株后病變圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 為了使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，運(yùn)些實(shí)施例 僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通 常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0017]實(shí)施例一 Vero細(xì)胞系的克隆和篩選 1.Vero細(xì)胞有限稀釋法克隆培養(yǎng) 將實(shí)驗(yàn)室保存的無支原體，細(xì)菌、真菌、外源病毒污染的Vero細(xì)胞經(jīng)膜酶消化制成單 細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋，然后分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C5%0)2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)15d，挑選有單個(gè)細(xì)胞生長的細(xì)胞孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板培養(yǎng)，并依次將細(xì)胞 擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得亞克隆細(xì)胞株。 陽〇1引 實(shí)施例二 非洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO的生物學(xué)性狀研究 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué) 分別接長成單層的非洲綠猴腎細(xì)胞系VeroBlO株制備成細(xì)胞懸液，加入含8%胎牛血 清的DMEM生長液，于37°C5%C02條件下培養(yǎng)4她，觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞貼壁良好、形態(tài)飽 滿、界限清晰，表面光滑。VeroBlO株較Vero母細(xì)胞細(xì)胞之間的界限更明顯、整齊，細(xì)胞折光 性強(qiáng)，胞質(zhì)飽滿，核質(zhì)清晰。
[0019] 2.細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢測 將長滿單層的VeroBlO和母本Vero細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，細(xì)胞按5XIOVmL接種到24孔板，加入含有8%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37°C5%C02條件下培養(yǎng)，每24h 取3個(gè)孔的細(xì)胞制成懸液，1:1的比例與臺(tái)吩藍(lán)混合后取10yL用細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀分別進(jìn)行 計(jì)數(shù)，=次測定結(jié)果取平均值，連續(xù)測定屯天。根據(jù)表格繪制生長曲線。 恭1迦懸竣潑識(shí)力榮穩(wěn)額爆
[0020] 由圖2可W看出，非洲綠猴腎